Роль нуклеотидов в регуляции процессов сверхсинтеза органических кислот у дрожжей Yarrowia lipolytica

• Автор: Солодовникова, Наталия Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 105 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 1. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДРОЖЖЕЙ Уситомпа Ііроіуііса, ПРОДУЦЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИХ

КИСЛОТ
1.1. Сверхсинтез лимонных кислот дрожжами при выращивании

на глюкозе
1.1.1. Физиологические особенности синтеза

лимонных кислот
1.1.2. Биохимические особенности процесса сверхсинтеза лимонных
КИСЛОТ
1.1.2.1. Ферментные системы, участвующие в метаболизме глюкозы
дрожжами
1.1.2.2. Изменение биоэнергетического состояния клеток дрожжей

в условиях лимитирования роста культуры источником азота
1.2. Сверхсинтез кетокислот дрожжами Уаггопча Ііроіуйса
при выращивании на глюкозе
ГЛАВА 2. НАД*-ЗАВИСИМАЯ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗА
НЕЕ РЕГУЛЯЦИЯ У ДРОЖЖЕЙ
2.1. Характеристика НАДДизоцигратдегидрогеназы
2.2. Влияние метаболитов на НАД*-изоцшратдегидрогеназу
2.3. НАД*-изоцитратдегидрогеназа и энергетический обмен
ГЛАВА 3. МЕТАБОЛИЗМ ИСТОЧНИКА АЗОТА У ДРОЖЖЕЙ
3.1. Ассимиляция аммония дрожжами
3.2. Активность ферментов начальных этапов азотного метаболизма

у дрожжей
3.3. Субклеточная локализация ферментов азотного метаболизма
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
4Л. Объект исследовании
4.2. Культивирование дрожжей
4.3. Методика контроля роста биомассы
4.4. Определение органических кислот в культуральной жидкости
4.5. Определение концентрации ионов аммония в

культуральной жидкости
4.6. Определение концентрации глюкозы в

культуральной жидкости
4.7. Измерение интенсивности дыхания и ингибиторный анализ
4.8. Экстракция нуклеотидов
4.9. Определение адениловых нуклеотидов
4.10. Определение пиридиннуклеотвдов
4.11. Получение бесклеточных гомогенатов
4.12. Субклеточное фракционирование
4.13. Определение активности ферментов
4.13.1. НАД*-зависимая изоцитратдегидрогеназа
4.13.2. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
4.13.3. Фумарат-гидратаза
4.13.4. НАД*-зависимая глутаматдегидрогеназа
4.13.5. НАДФ*-зависимая глутаматдегидрогеназа
4.13.6. Аланинаминотрансфераза
4.13.7. Аспартатаминотрансфераза
4.13.8. Глутаминсинтетаза
4.14. Очистка НАД*-зависимой изоцитратдегидрогеназы
4.15. Определение молекулярного веса и субъединичного
состава НАД*-зависимой изоцитратдегидрогеназы
4.16. Определение концентрации белка

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 5. ДИНАМИКА АДЕНИЛОВЫХ И ПИРИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica В УСЛОВИЯХ СВЕРХСИНТЕЗА
ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ
5.1. Рост дрожжей Y. lipolytica 704 на глнжозе
в условиях лимитирования источником азота
5.2. Интенсивность дыхания и чувствительность
к цианиду при лимитировании роста дрожжей источником азота
5.3. Экстракция нуклеотидов
5.4. Внутриклеточное содержание адениловых нуклеотидов
при лимитировании роста дрожжей источником азота
5.5. Внутриклеточное содержание НАД* иНАДН
при лимитировании роста дрожжей источником азота
5.6. Рост дрожжей Y. lipolytica 704 на глюкозе при
лимитировании тиамином
5.7. Интенсивность дыхания и чувствительность
к цианиду в условиях лимитирования роста дрожжей тиамином
5.8. Внутриклеточное содержание адениловых и пиридиновых

нуклеотидов в клетках дрожжей, лимитированных тиамином
ГЛАВА 6. МЕТАБОЛИЗМ ИСТОЧНИКА АЗОТА
У ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica
6.1. Динамика активностей ферментов начальных этапов
метаболизма азота
6.2. Локализация ферментов азотного обмена
ГЛАВА 7. ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГУЛЯЦИИ НАДДЗАВИСИМОЙ
ИЗОЦИТРАТ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica
7.1. Очистка НАДДизоцитратдегидрогеназы
7.2. Характеристика НАДДизоцитратдегидрогеназы
7.3. Влияние метаболитов на активность I (АД1 -изоцитратдегидрогеназы
калибровочной кривой, построенной с использованием стандартных растворов сернокислого аммония.
4.6. Определение концентрации глюкозы в культуральной жидкости
Для определения концентрации глюкозы использовали набор реактивов фирмы "Lachema" (Чехия). Определение глюкозы основано на реакции, катализируемой глюкозооксидазой:
глюкоза + Ог- * глюконолактон + Н202
Образующаяся в ходе данной реакции перекись водорода вызывает окисление субстратов пероксидазы с образованием окрашенного продукта. Увеличение оптической плотности раствора пропорционально концентрации глюкозы в реакционной смеси.
Реакционная смесь содержала (2 мл): 33 мМ трис-HCI (pH 8,4); субстраты пероксидазы, глюкозооксидазу 15 Ед/мл, пероксидазу 20 Ед/мл; образец или стандарт глюкозы (5мМ). Реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Через 10-15 минут после начала инкубации пробирки интенсивно встряхивали. После инкубации измеряли оптическую плотность при 500 нм на спектрофотометре "Specol-21".
Расчет концентрации глюкозы проводили по формуле: С = (Ао / Аст) х 5 ммоль/л, где Ао и Аст - оптические плотности образца и стандарта, соответственно, измеренные относительно реакционной смеси не содержащей глюкозу.
4.7. Измерение интенсивности дыхания и ингибиторный анализ
Интенсивность дыхания определяли на полярографе “1,-27" (ЧССР) в полярографической ячейке со стандартными электродами типа электрода Кларка (объем ячейки 2мл). Потребление кислорода интактными клетками измеряли при 28°С. В качестве среды дыхания использовали 50 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,2). Скорость