Влияние гидрокортизона на синтез мРНК, кодирующей тирозинаминотрансферазу в печени крыс

• Автор: Блинова, Наталия Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 199 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .

ШВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . II

1.1. Общие механизмы действия стероидных гормонов как индукторов синтеза белка в тканяхмишенях II

1.1.1. Ферментативная индукция как механизм регуляции жизнедеятельности организмов

1.1.2. Механизмы рецепции стероидных гормонов в клеткахмишенях животных

1.1.3. Механизмы гормональной индукции ферментов в тканяхмишенях. Использование специфических комплементарных ДНК кДНК для исследования синтеза и деградации матричных РНК при гормональной индукции.

1.2. Влияние глюкокортикоидов на состояние белоксинтезирукщего аппарата .

1.2.1. Действие глюкокортикоидов на содержание различных видов РНК в клеткахмишенях и на процесс транскрипции .
1.2.2. Влияние глюкокортикоидов на пооттранскрипционнуто модификацию РК и на полисошшй аппарат клетскмишеней .

1.2.3. Действие глюкокортикоидов на процессы деградации мРНК.

1.3. Тирозинаминотпансфераза ТАТ печени крыс как модель для исследования механизмов глюкокортиковдной индукции ферментов
ГЛАВА П. МТЕШАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и реактивы, использованные в экспериментах.
2.2. Характеристика подопытных животных. Введение гормонального индуктора
2.3. Хроматографические методы фракционирования белков из печени крыс
2.4. Определение активности ТАТ
2.5. Аналитический электрофорез белков в полиакриламидном Стр.
геле ПЛАТ .
2.6. Получение моноспецифических антител к ТАТ
2.6.1. Иммунизация кроликов очищенной тирозинашнотраисферазой
2.6.2. Выделение суммарной глобулиновои фракции
ИЗ сыворотки кроликов, иммунизированных ТАТ.
2.7. Приготовление вторых антител Тц козла против 1ц кролика
2.8. Методы иммунохимического анализа антител и очищенных белков
2.8.1. Двойная иммунодиффузия в агаровом геле по Оуктерлони.
2.8.2. Аналитический иммуноэлектрофорез в агаровом
2.8.3. Выявление специфической активности ТАТ в иммунопреципитатах
2.8.4. Радиоактивное мечение глобулинов кролика, специфичных к ТАТ
2.9. Получение иммуносорбентов для фракционирования полирибосом .
2 Выделение суммарных полирибосом из печени крыс
2 Седшлентационный анализ полирибосом .
2 Приготовление полиУ сефарозы 4В.
2 Выделение полиА содержащей мРНК из полирибосом печени крыс путем аффинной хроматографии на полиУ сефарозе 4В
2 Определение удельной радиоактивности полисомной по
лиА содержащей РНК.
2 Определение удельной радиоактивности пула уридиновых нуклеотидов в печени крыс .
2 Седшлентационный анализ РЖ в градиенте плотности сахарозы
2 Электрофоретический анализ препаратов РНК в агароз Стр.
них гелях
2 Получение бесклеточной белокоинтезирующей системы экстракта Э из зародышей пшеницы .
2 Трансляция полисомной полиА содержащей РНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы .
. Электрофоретический анализ продуктов трансляции
. Иглмуиопреципитация продуктов трансляции
2 Выделение специфической глРНК ТАТ из печени крыс
2 Синтез комплементарной ДНК на мРНК ТАТ
2 Центрифугирование кДЕЖ в щелочном градиенте плотности сахарозы
2 Электрофорез препаратов кДНК в агарозных гелях с мочевиной .
2 Гибридизация кДНК ТАТ о суммарной полиА содержащей
РНК, выделенной из полирибосом печени крыс
ГЛАВА Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ ЗКСНЕРШ.ЕНТАЛЫЮГО ИССВДОВАНИЯ
3.1. Выделение и очистка анодного изофермента ТАТ из печени крыс
3.2. Получение специфических гипершлмушшх сывороток к анодному из ферменту ТАТ очистка глобулинов
3.3. Влияние гидрокортизона на метаболизм и матричную активность лолисомной полиА содержащей РНК в печени
3.3.1. Результаты седиментацнонного анализа полирибосом, выделенных из печени интактных и индуцированных гидрокортизоном крыс .
3.3.2. Выделение суммарной полиА содержащей РНК из полирибосом печени крыс. Изменение содержания меченой полиА содержащей РНК в полирибосомах печени при введении гидрокортизона
3.3.3. Характеристика удельной радиоактивности дула уридиновых нуклеотидов в печени крыс при введении гидрокортизона .
3.3.4. Изменения удельной радиоактивности полисомнок полиА РНК в динамике индукции гидрокортизоном
3.3.5. Включение предшественников в полисомную полиА содержащую РНК печени в норме и при индукции гидрокортизоном .
3.3.6. Изменения трансляционной активности полисомной полпА содержащей РНК под действием гидрокортизона . НО
3.4. Определение синтеза специфического продукта, осаждаемого антителами к ТАТ, при трансляции i vi полиА содержащей РЖ из полирибосом печени интактных
и индуцированных животных.
3.5. Выделение специфической МРНК ТАТ из печени крыс и исследование полученного препарата .
3.5.1. Выявление фракции полкрибосом печени, синтезирующих ТАТ
3.5.2. Выделение специфической мРЖ ТАТ из полпри
босом печени крыс .
3.5.3. Определение размеров мРЖ ТАТ методом центрифугирования В ГраДИеНТе ПЛОТНОСТИ СахарОЗЫ
3.5.4. Измерение матричной активности препаратов
мРНК ТАТ в бесклеточной системе синтеза белка
3.5.5. Исследование матричных свойств мРНК ТАТ в системе обратной транскрипции. Анализ размеров полученной комплементарной ДЖ.
3.6. Сравнение концентрации мРЖ ТАТ в клетках печени крыс в динамике индукции гидрокортизоном методом гибридизации суммарной полиА содержащей РНК с высокомеченой
кДЖ ТАТ.
ГЛАВА ГУ. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Выводы
Список литературы


Содержание двух, других изоферментов тимидинкиназы не изменяется при введении гормона . I0. Тестостерон также индуцирует активность тимидинкиназы в матке неполовозрелых крыс. При одновременном введении эстрадиола и тестостерона наблюдается синергический эффект i , . Следует отметить, что гормональная регуляция активности ферментов метаболизма углеводов, таких, как гексокиназа, глюкозо 6 фосфатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, пируваткиназа также обеспечивается в ряде случаев индукцией лишь определенных изоферментов i . Так, введение тестостерона кастрированным крысам вызывает увеличение активности лишь одного из четырех изоферментов глюкозо 6 фосфатдегидрогеназы в простате , i, , а инсулин индуцирует в чувствительных тканях преимущественно один изофермент гексокиназы гексокиназу П ГПас1йу а, Но а,
i , . Молекулярные эффекты действия гормонов к настоящему времени изучены достаточно подробно и во многих случаях они заключаются в изменении активности ферментов, катализирующих определенные реакции обмена веществ. При этом возрастание ферментативной активности может быть следствием как активации уже пре,Ьцествующих ферментов, так и синтеза ферментных белков v , i ,. В соответствии с рекомендацией Комиссии по ферментам Международного биохимического союза гормональной индукцией фермента следует считать вызываемое гормоном увеличение синтеза ферментного белка синтез фермента Диксон,Уэбб, . Помимо изменения активности ферментов в клеткахмишенях стероидные гормоны влияют на синтез яеферментных белков, на развитие, и дифференцировку тканей. Наглядным примером является действие половых стероидов на организм млекопитающих. Так,введение эстрогена вызывает быстрые и разнообразные ответы в различных тканяхмише нях усиленный рост вагинального эпителия, синтез и аккумуляцию жира в жировых клетках, рост тканей молочной железы, супрессию продукции гонадотропина под действием гормона на гипоталямо гипофизарную систему. Среди этих эффектов эстрогена наиболее выраженным количественно и легко поддающимся биохимическому анализу является ответ матки. Однократная инъекция физиологической дозы эстрогена быстро превращает атрофированную матку неполовозрелых или овариэктомированных самок крыс в активно растущий орган. В течение нескольких минут уровень гистамина в матке снижается, а уровень цАМФ увеличивается. Уже через часов после введения эстрадиола увеличивается сухой вес матки. Усиление процессов роста отражается на биохимическом составе орга
на в течение первых часов после введения эстрогена в клетках матки повышается содержание фосфолипидов, а затем увеличивается синтез РНК п белка ГПыеНег, i i. Эстрогены и прогестерон вызывают быстрое увеличение массы яйцевода неполовозрелых, птиц в 0 раз в течение суток и дифференцировку 3х типов эпителиальных клеток. Эти процессы сопровождаются появлением овальбуминовой мрнк в полирибосомах яйцевода и индукцией синтеза овальбумина , i, . При введении цыплятам, предварительно подвергнут первичной эстрогенизации, эстрадиолбензоата или прогестерона синтез кональбуминовой . РНК увеличивается в раза уже через минут, а синтез мРНК овальбушна, не обнаруживаемый до введения гормона, увеличивается более, чем в раз в течение часов I, i, . Вителлогенин предшественник липовитедлина и фосвитина. Эстрогены стимулируют синтез вителлогенина и его производных в печеш птиц и амфибий. Особенностью действия эстрогенов является более быстрое и более выраженное образование вителлогенина при повторной стимуляции эстрогенами. Это было продемонстрировано как по образованию вителлогенина, так и по образованию вителлогениновой мРНК. Методом молекулярной гибридизации показано, что в геноме печени петухов имеется гонов, экспрессия которых изменяется после введения эстрогенов , , . Представляет интерес работа лаборатории Талвара по индукции эстрадиолом синтеза фосвитина в печеш петухов. В плазме фосвитин появляется через часа после введения эстрадиола. Его появлению предшествует возрастание синтеза РНК через 0, часа после введения гормона и ДНК через часов.