Использование антител для количественного определения, очистки и локализации регуляторов роста растений и их метаболитов

• Автор: Веселов, Станислав Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 260 с. : ил.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Способность растения регулировать свои функции и обеспечивать согласованный ответ на внешние воздействия на уровне целого организма определяет их выживание в постоянно изменяющихся условиях обитания. Основная роль в интегративных процессах отводится фитогормонам. Полное понимание того, как именно гормоны растений осуществляют свою регуляторную 'функцию, является необходимой предпосылкой использования гормонов для управления жизнью растения в нужном человеку направлении. Однако, в гормональной теории все еще остается много неясного. Так предполагается, что в основном регуляторная функция гормонов реализуется через изменение их концентрации (Холодный, 1935; Went, 1936; Leopold, Nooden, 1994). Следует отметить, что до сих пор до конца не ясно, каким образом растение контролирует концентрацию своих гормонов. По крайней мере требует выяснения относительная роль систем синтеза, транспорта и дальнейшей биоконверсии гормонов в регуляции их концентрации. У растений могут накапливаться весьма значительные количества запасных форм гормонов (Reinecke, Banduski, 1987). Предполагается, что взаимопревращение свободных и запасных форм гормонов - это альтернативный, возможно наиболее важный, способ регуляции их концентрации, степень мобильности которого практически еще не изучалась. Дефицит знаний о том, как растение регулирует концентрацию своих гормонов, может быть причиной того, что до сих пор применение регуляторов роста в растениеводстве не дало ожидаемых результатов.
Недостаточность сведений о принципах функционирования гормональной системы растений связана со сложностью изучения гормонов, что объясняется очень низким содержанием регуляторов роста в тканях и необходимостью их длительной очистки перед определением с помощью физикохимических методов. Поэтому применение антител к гормонам с целью увеличения селективности детекции и высокая чувствительность иммуноанали-

за позволяет на новом уровне решить проблему количественного определения гормонов. В то же время использование антител для одностадийной очистки гормонов с помощью иммуноаффинной хроматографии может сделать гораздо менее трудоемкими физико-химические методы анализа. Еще одно перспективное направление в гормонологии связано с применением иммуно-химических методик в сочетании с гистологической техникой для изучения функционального значения распределения фитогормонов на уровне клеток и тканей.
Вместе с тем за время, прошедшее после первых попыток использования антител для изучения гормонов растений (Pengelly, Meins, 1977; Weiler, 1979), стало очевидно, что несмотря на колосальные возможности нового подхода, его необдуманное применение таит опасность получения артефактов. Наличие в растительных объектах компонентов, обеспечивающих специфическую и неспецифическую интерференцию, требует разработки способов повышения специфичности анализа и обозначения пределов необходимой и достаточной степени очистки образцов для получения достоверных результатов. С другой стороны могут возникнуть ситуации, когда необходимо расширять специфичность анализа. Например, при отборе синтетических гормонподобных соединений, скрининге микроорганизмов-продуцентов фитогормонов и др.
Довольно большое разнообразие применявшихся и описанных в литературе подходов для изучения гормонов растений с помощью иммунохими-ческих методов обуславливает необходимость обобщения накопленного опыта. В то же время наметившийся новый уровень исследования метаболизма регуляторов роста растений требует и новых нестандартных решений.
Цель настоящей работы состояла в разработке принципов регулирования специфичности, чувствительности, а также надежности иммунохими-ческих методов изучения гормонов и демонстрации их возможностей в ис-

следовании различных аспектов биохимии регуляторов роста растений. Для этого было необходимо:
1. Получить антитела к гормонам: ИУК, АБК и дитокининам (зеатинрибозиду, дигидрозеатинрибозиду и изопентениладенозину), - и на этой основе приготовить тест-системы для их количественного определения.
2. Изучить влияние разведения иммунореагентов, химической модификации гаптенов, замены гормонов в гомологичных системах на их структурные аналоги, а также использование систем усиления сигнала на специфичность и чувствительность иммуноанализа регуляторов роста растений.
3. Разработать методы устранения интерференции за счет повышения селективности экстракционной очистки, иммуноаффиной хроматографии и сочетания хроматографического разделения с иммуноферментным анализом.
4. Провести сравнение иммунохимических и физико-химических методов количественного определения и идентификации фитогормонов.
5. Оценить возможности иммуноанализа для отбора гормоноподобных синтетических соединений путем определения физиологической активности отобранных веществ.
6. Исследовать особенности определения гормонов, продуцируемых ризосферными микроорганизмами, иммунохимическими методами.
7. Провести исследование метаболических превращений гормонов с помощью иммунохимических методов, включая сопоставление динамики гормонов и их иммунореактивных метаболитов в онтогенезе на фоне различных воздействий.
8. Разработь метод гистохимической локализации гормонов растений с использованием антител и продемострировать его возможности на примере исследования трансгенных растений, отличающихся гиперпродукцией гормонов.
Научная новизна. Обоснованы теоретические и практические аспекты регулирования специфичности иммуноанализа в системе с твердофазным антиге-

антителами, защищает гормон от возможного окисления. Тем самым увеличивается стабильность выделенного препарата. В варианте же, который нацелен на определение неметелированной ИУК требуется иная защита препарата от окисления. Так авторы указывают на необходимость проведения упаривания экстракта в атмосфере азота (Pengelly, Meins, 1977). Все это делает более удобным вариант анализа, основанный на использовании "С-1" антител. Хотя в варианте с "С-1" антителами требуется разделение свободных и связанных форм, это может быть легко осуществлено, о чем речь пойдет в дальнейшем. И наконец, преимущество "N" антител, которые казалось бы позволяют определять содержание гормона без его предварительного отделения от присутствующих связанных форм, нивелируется тем фактом, что в "грубом", т.е. неочищенном растительном экстракте присутствуют неспецифические компоненты, которые мешают определению гормонов с помощью антител, и от которых экстракт так или иначе нужно освобождать (см. раздел 3).
Рис. 2.1.4. Изменение иммунореактивности
препарата ИУК под действием
пероксидазы хрена

Время инкубации, мин
Для определения свободной формы индолилуксусной кислоты была также предложена сыворотка, полученная к комплексу ИУК-белок, в котором