Роль белок-белковых взаимодействий в стабилизации АПО- и холоформ глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из Bacillus Stearothermophilus

• Автор: Ивинова, Ольга Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. О-ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА
1.1. Основные свойства и функции в клетке
2. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ГАФД
2.1. Олигомерное строение дегидрогеназы
2.2. Роль междоменных взаимодействий в связывании
кофактора
2.3. Межсубъединичная кооперативность дегидрогеназы
2.4. Полуцентровая реактивность дегидрогеназы
3. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ СКАНИРУЮЩАЯ
КАЛОРИМЕТРИЯ КАК МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ
3.1. Техника сканирующей калориметрии
3.2. Калориметрические измерения
3.3. Анализ результатов
3.3.1. Термодинамический анализ данных
3.3.2. Кинетический анализ данных
3.3.3. Анализ термоденатурации мультидоменных белков
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1. Получение нативных препаратов ГАФД дикого типа и
мутантных форм
4.1.1. Получение компетентных клеток ХЬ-1 Е.соИ
4.1.2. Трансформация плазмид
4.1.3. Выделение ГАФД B.st. дикого типа и мутантных форм

4.1.4. Выделение ГАФД из скелетных мышц кролика
4.1.5. Получение апоформ ГАФД
4.2. Аналитические методы
4.2.1. Определение концентраций реагентов
4.2.2. Определение концентрации белка в растворе
4.2.3. Определение концентрации белка, иммобилизованного на
сеарозе
4.2.4. Электрофорез белков и клеток в ПААГ в
денатурирующих условиях
4.2.5. Определение ферментативной активности лизоцима
4.2.6. Определение ферментативной активности ГАФД
4.2.7. Изучение быстрой кинетики реакции образования ацил-
фермента
4.2.8. Изучение связывания NAD+ апоформой ГАФД дикого
типа и мутантов
4.2.9. Определение коэффициента седиментации
4.2.10. Дифференциальная сканирующая калориметрия
4.2.11. Регистрация спектров кругового дихроизма
4.2.12. Турбидиметрическое титрование полиэлектролитов
белком
4.2.13. Термоинактивация лизоцима свободного и в присутствии
полиэлектролита
4.3. Метод иммобилизации
4.3.1. Активация сефарозы
4.3.2. Иммобилизация ГАФД В.st
4.4. Получение иммобилизованных форм ГАФД различной
степени нативности и олигомерности
4.4.1 Получение денатурированных мономерных форм ГАФД

4.4.2. Получение иммобилизованных на сефарозе активных
димеров дикого типа ГАФД B.st
4.4.3. Реассоциация иммобилизованных димерных форм ГАФД
с субъединицами из раствора
5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
5.1. Получение и характеристика термостабильных ГАФД
дикого типа и мутантных форм
5.1.1. Трансформация плазмид в штамм-суперпродуцент ХЬ-
Е.соИ
5.1.2. Выделение и характеристика ГАФД В. st. дикого типа
и мутантых форм
5.2. Роль внутрисубъединичных взаимодействий в
стабилизации апо- и холотеграмерной ГАФД Л.дГ
5.3. Роль межсубъединичных взаимодействий в стабилизации
апо- и холотетрамеров ГАФД
5.4. Роль межсубъединичных взаимодействий в стабилизации
апо- и холодимеров ГАФД В.в!
5.5. Роль белок-полиэлектролит взаимодействий в
стабилизации белков
5.5.1. Анализ термостабильности комплексов белок-полианион
методом ДСК, обратимость воздействия полиэлектролитов на белки
5.5.2. Получение нерастворимых белок-полиэлектролитных
комплексов и их изучение методом турбидиметрического титрования
5.5.3. Термоинактивация фермент-полианион комплекса при
температурах близких к максимуму тепловой
денатурации
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

структуры белка, т.е. о роли меж- и внутримолекулярных взаимодействий в стабилизации макромолекулы. В настоящее время вклады отдельных аминокислотных остатков в температурную стабильность белка изучаются с применением методов сайт-направленного мутагенеза. Применение методов генетической инженерии для введения точечных и блочных мутаций в белковой молекуле позволяет выяснить природу взаимодействий, определяющих стабильность пространственной структуры белка и установить взаимосвязь между структурой и функцией.
3.1. Техника сканирующей калориметрии
Первые дифференциальные калориметры, появившиеся в середине шестидесятых годов, обладали чувствительностью на три порядка выше, чем у абсолютных калориметров, существовавших к тому времени (Privalov P.L. 1985; Privalov P.L., and Potekhin S.A., 1986; Sturtevant J.M., 1974; Wadso I., 1970; Privalov P.L., et al., 1995). Наиболее важным шагом для увеличения чувствительности стало уменьшение размеров калориметрических ячеек, что позволило снять проблему температурных градиентов в ячейках при непрерывном нагреве, а также исключить необходимость механического перемешивания. Следующим важным шагом стало применение неизвлекаемых ячеек с фиксированным объемом, что позволило повысить точность и воспроизводимость их заполнения, а, следовательно, и получаемых результатов. Это сделало возможным определение абсолютных значений избыточной теплоемкости белков и нуклеиновых кислот в разбавленных растворах в широком диапазоне температур (Privalov P.L., and Khechinashvili N.N., 1974). Первый сканирующий калориметр называется ДАСМ-1М.
Дальнейшее усовершенствование было достигнуто путем использования капиллярных спиральных калориметрических ячеек, которые позволили снизить температурный градиент в ячейках, существенно