Митохондриальной АТФ-чувствительный калиевый канал и его роль в адаптации организма к гипоксии

• Автор: Качаева, Евгения Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 128 с. : ил.

Оглавление
Введение

Обзор литературы

1. Системы транспорта калии в МХ.

1.1. Транспорт калии в МХ.

1.2. Молекулярные структуры, ответственные за транспорт калия в МХ.

1.3. Физиологическое значение транспорта калия в МХ.

2. АТФингнбнрусмые калийтранспортирующнс каналы.

2.1. АТФзависнмый калиевый канал цитоплазматической мембраны.

2.1.1. Структу рная организации цитоплазматического

АТФзависимого калиевого канала.

2.1.2. Биофизические свойства цитоплазматического калиевого капала.
2.1.3. Модуляторы цитоплазматического калиевого канала.
2.1.3.1. Внутриклеточные нуклеотиды регуляторы цитоКдтф капала.
2.1.3.2. Фармакологические регуляторы цитоКдтф канала.
2.1.4. Функциональная роль цитоКдтф канала в клетке.
2.2. АТФчувствнтсльнын калиевый канал внутренней мембраны МХ.
2.2.1. Структурная организация митоКдтф капала.
2.2.2. Биофизические свойства митоКдтф канала.
2.2.3. Модуляторы митоКдтф канала.
2.2.3.1. Метаболические модуляторы митоКдтф канала.
2.2.3.2. Фармакологические модуляторы митоКдтф канала.
2.4. Функциональная роль митоКдтф.
2.4.1. Активация митоКдтф в развитии устойчивости организма к гипоксии.
2.4.2. Механизмы защиты сердца при гипоксии,
опосредованные активацией митоКдтф.
2.4.3. Феномен прерывистой гипобаричсской тренировки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Выделение МХ.
1.1. Выделение МХ печени крысы.
1.2. Выделение МХ сердца крысы
2. Выделение и очистка митоКдтф канала.
3. Изучение энергозависимого входа К в МХ методом спсктрофогомстрии.
4. Изучение ДНФиндуппрованного выхода попов калии из МХ.
5. Полярографическое определение параметров дыхания МХ.
6. Иммунохимическое исследование митоКдтф канала.
6.1. Получение и очистка антител к белку с молекулярной массой кДа.
6.1.1. Подготовка белка с м.м. кДа выделение и очистка.
6.2. Иммунизации м анализ препарата антител.
6.2.1. Детекция специфических антител и определение титра.
6.2.1.1. Непрямой Дотанализ.
6.2.1.2. ВестерпБлот анализ.
6.3. Очистка антител к АТФзавнснмому белку с м.м. кДа.
6.4. Ингибиторный анализ с использованием антител к белку с м.м. кДа.
7. МБМЛЫМТОЕТОЕ анализ.
8. Модель экспериментального острого инфаркта миокарда.
8.1. Хирургические процедуры и модели животных.
8.2. Схема эксперимента
8.3. Анализ электрокардиограмм.
8.3.1. Анализ ишемических нарушений.
8.3.2. Анализ нарушений ритма.
8.4. Критерии отбора.
8.5. Статистический анализ.
9. Определение параметров функционирования митоКдтф капала
крыс высоко и пизкоустойчивых к гипоксии.
9.1. Метод отбора высоко и пизкоустойчивых животных.
9.2. Адаптирование пизкоустойчивых животных к недостатку кислорода
методом прерывистой нормобарнчсской гипоксии.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изучение физиологической роли митоКдтф капала при гипоксии.
1.1. Изучение влияния активации митоКдтф канала уридиновыми нуклеотидами на повреждения миокарда при
ишемии на модели экспериментального острого инфаркта миокарда.
1.1.1. Влияние уридина и уридинмонофосфата па ишемические изменения сердечной активности, при введении препаратов
до и после создания экспериментального инфаркта.
1.1.2. Антиншсмнчсское действие уридина и урндннЗмонофосфата.
1.1.3. Антиаритмнчсский эффект уридина и урндипЗмонофосфата.
1.2. Параметры функционирования митоКдтф канала у крыс с различной резистентностью, а также у животных, адаптированных к гипоксии.
1.2.1. Изучение параметров дыхания и окислительного фосфорилирования
в X печени и сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии.
1.2.2. Изучение параметров АТФзависимого транспорта К в МХ печени
сердца крыс с различной резистентностью к гипоксии.
2. Изучение структурной организации митохондриального
АТФзависимого калиевого канала.
2.1. Определение гомологии белка с м.м. кДа методом
МБМ АЬ ШТО РТ ОР.
2.2. Ингибиторный анализ активности митоКдк канала с использованием антител, полученных на белок с м.м. кДа.
2.2.1. Определение степени чистоты белка, используемого для иммунизации.
2.2.2. Иммунизация и определение титра полученных антител.
2.2.3. Определение специфичности полученных антител.
2.2.4. Выделение иммуноглобулинов С 1цС из антисыворотки и
проведение ингибиторного анализа.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Да, обладающий свойствами данного канала, был изолирован из X мембраны в виде Миронова и др. Позднее было показано, что выделенный белокканал ингибируется физиологическими концентрациями АТФ . Миронова и др. В настоящее время достаточно хорошо исследованы биофизические свойства митохондриального калиевого канала и его физиологическая роль Миронова и др. I, II . I . Интерес к исследованию этого канала в последнее время возрос, поскольку было показано, что он, а именно его активация, играет ключевую роль в защите миокарда при ишемии v . V , . Найден целый ряд синтетических активаторов митоКдтф, являющихся потенциальными кардиопротекторами . Недавно в лаборатории проф. Мироновой был обнаружен эффективный природный метаболический активатор митоКдтф уридин5днфосфат УДФ iv . Псгода А. Е., . Метаболические активаторы канала имеют ряд преимуществ, по сравнению с их синтетическими аналогами, поскольку их концентрацию в клетке можно рейдировать и они не обладают отрицательными побочными эффектами. Действие УДФ, как активатора Кканала, и, следовательно, кардиоиротектора, до настоящего времени не было изучено на животных. Ьи е1 а1. Однако прямые доказательства участия канала в адаптации к гипоксии до настоящего времени не получены, то есть, данный феномен также требует дополнительных исследований. Настоящая работа посвящена поиску новых путей кардиопротекции, так как, несмотря на большие усилия, направленнные на лечение сердечнососудистых заболеваний, они все еще являются одной из первых причин смертности в мире. Таким образом, актуальность поиска новых подходов к предупреждению и лечению этих заболеваний не вызывает сомнений. В настоящее время большинство исследователей считает, что конечным эффектором кардиопротекции, вызванной прекондицией, является митоКдтф Усоп а а. Петрищев и др. Как уже упоминалось выше, физиологическая роль и параметры функционирования митоКдтф достаточно хорошо изучены, однако, его структурная организация до сих пор остается неизвестной. Изучение структуры митоКдтф позволит исследовать функцию и регуляцию канала на молекулярном уровне. В связи с этим, целью данной работы было изучить кардиопротекторное действие предшественников УДФ при ишемии миокарда, а также исследовать параметры функционирования митоКдтф У животных с различной устойчивостью к гипоксии, а также у крыс, адаптированных к кислородному голоданию , а также выяснить структурную организацию митоКдтф. Изучить кардиопротекторное антиишемическое и антиаритмическое действие специфического активатора митоКдтф уридиндифосфата на модели острого инфаркта миокарда у крыс. Исследовать параметры функционирования митоКдтф У крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также у животных, адаптированных к недостатку кислорода. Определить гомологию структуры исследуемого белка с м. Да аминокислотным последовательностям известных белков. Провести ингибиторный анализ АТФчувствительного транспорта калия в нативных МХ с использованием полученных антител АТ с цслыо доказательства принадлежности белка с м. Да к системе АТФзависимого транспорта К в МХ. Новизна исследовании. В данной работе впервые изучено антиишемическое и антиаритмическое кардиопротекторнос действие веществ уридинового ряда природных активаторов митоКдтф, на модели инфаркта миокарда. Впервые также исследовались параметры функционирования митоКдтф У крыс с различной устойчивостью к гипоксии, а также изучалась роль канала в формировании адаптации к кислородному голоданию у животных. Проведено сравнение гомологии структуры митоКдтф с аминокислотной последовательностью известных белков. Научпопрпктичсскос значение работы. Представленная работа имеет научнопрактическое значение, поскольку в работе обнаружено, что метаболический активатор митоКдтф обладает выраженными антиишемическим и антиаритмическим свойством, то есть играет существенную роль в защите миокарда от ишемических повреждений. Изучение роли активации митоКдтф при тренировке животных к недостаточности позволит в дальнейшем разработать пути жизнеспособности организма в условиях гипоксии.