Направленный мутагенез рековерина

• Автор: Зинченко, Дмитрий Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 110 с. : ил

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Молекулярные механизмы передачи сигнала в фоторецепторной
КЛЕТКЕ
1.1.1 Родопсин
1.1.2 Трансдуцин
1.1.3 cGMP-фосфодиэсгпераза
1.1.4 cGMP-зависимый катионный канал
1.2 Механизмы выключения сигнала в фоторецепторной клетке и
ВОССТАНОВЛЕНИЕ ТЕМН0В0Г0 СОСТОЯНИЯ
1.2.1 Выключение родопсина
1.2.2 Выключение трансдуцина и фосфодиэстеразы
1.2.3 Светозависимое изменение концентрации Са''+ в фоторецепторной
клетке
1.2.4 Гуанилатциклаза
1.3 Са2"-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ НСП, ПРИНИМАЮЩИЕ УЧАСТИЕ В ФОТОТРАНСДУКЦИИ
1.3.1 Общая характеристика Са2^ -связывающих белков, содержащих структуру типа "EF-hand"
1.3.2 Общая характеристика калъмодулина
1.3.3 Активатор гуанилатциклазы 1 и
1.3.4 Нейрокальцин
1.3.5 Рековерин
2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы и реактивы
2.2 Ферменты
2.3 Методы
2.3.1 Выделение ДНК плазмид из бактериальных клеток
2.3.2 Выделение одноцепочечной формы фага М13тр
2.3.3 Олигонуклеотид-направленный мутагенез рековерина
2.3.4 Приготовление компетентных клеток
2.3.5 Трансформация E.coli
2.3.6 Отбор мутантных клонов
2.3.7 Электрофорез ДНК в агарозных гелях
2.3.8 Секвеи ирован ие ДНК
2.3.9 Экспрессия рековерина и его мутантов в клетках E.coli
2.3.10 Выделение мутантных рекомбинантных рековеринов
2.3.11 Определение степени миристоилирования рекомбинантных рековеринов
2.3.12 Выделение наружных сегментов палочек сетчатки (НСП)
2.3.13 Получениеродопсинкиназы и отмытых мочевиной мембран НСП.
2.3.14 Фосфорилирование родопсина в суспензии НСП
2.3.15 Определение активности родопсинкиназы в реконструированной системе
2.3.16 Прямое связывание радиоактивного 45Са2+ с рековерином и его мутантными формами
2.3.17 Связывание рековерина и его мутантных форм с фоторецепторной мембраной
2.3.18 Аналитические процедуры
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Получение и выделение рековерина и его мутантных форм
3.1.1 Клонирование и экспрессия мутантных форм рековерина, модифицированных по Са2 -связывающим участкам
3.1.2 Выделение миристоилированного и немиристоилированного рековерина дикого типа и его мутантных форм
3.2 Изучение механизма С а2+-зависимого экспонирования миристоильной группы рековерина
3.2.1 Связывание Са2+ рековерином и его миристоилированньши и немиристоилированными мутантными формами ЯсЕЕ2- и ЯсЕЕЗ
3.2.2 Связывание рековерина и его миристоилированных и немиристоилированных мутантных форм ЯсЕЕ2- и ЯсЕЕЗ- с фоторецепторными мембранами
3.2.3 Функциональная активность рековерина и его миристоилированных и не миристоилированных мутантных форм ЯсЕЕ2- и ЯсЕЕЗ
3.3 Изучение мутант)них форм рековерина с четвертым реконструированным Са2+-связывающим центром
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список принятых сокращений
БСА-бычий сывороточный альбумин ДСН-додецилсульфат натрия НСП-наружный сегмент палочек ПААТ-полиакриламидный гель ПКА - протеинкиназа А ПКС - протеинкиназа С
цГМФ - циклический 3', 5'-гуанозинмонофосфат
ЭГТА - бис-(2-аминоэтиловый) эфир этиленгликоль N,N,N',N'-TeTpayKcycHofi кислоты
Mr-молекулярная масса
nRc - немиристоилированный рековерин
mRc - миристоилированный рековерин
RcWT - рековерин дикого типа
Rh-родопсин
RK - родопсинкиназа
SspA - фрагмент белка А из Staphylococcus aureus TEMED - ]М,М,1чГ,1Ч'-тетраметилэтилендиамин

диссоциации из комплекса с Та-йТР и тем самым предотвращает реассоциацию Т(3у с Га-ОТР. Взаимодействию фосдуцина с Т(3у препятствует его фосфорилирование сАМР-зависимой протеинкиназой (ГЖА) [142].
Таким образом, при высокой концентрации Са2', что соответствует темноадаптированному состоянию фоторецепторной клетки, кальмодулин активирует аденилатциклазу и, соответственно, синтез сАМР; увеличение уровня сАМР приводит к активации ГЖА и увеличению доли фосфорилированной формы фосдуцина. С другой стороны, при низком уровне концентрации Са2+, когда доля нефосфорилированной формы фосдуцина возрастает, значительная доля Тру не способна взаимодействовать с Та и скорость активации фосфодиэстеразного каскада резко уменьшается. Такой механизм регуляции активации трансдуцина может играть важную роль в процессах световой адаптации фоторецепторной клетки, обеспечивая модуляцию величины ее электрофизиологического ответа в зависимости от уровня освещенности [142].
1.3.3 Активатор гуанипатциклазы 1 и
Активатор гуанилатциклазы 1 (АГЦ1) - одноцепочечный белок, который содержит в своем составе 205 аминокислотных остатков (52% гомологии с рековерином) и имеет расчетную Млу равную 22.8 кДа [92]. На основании
аминокислотной последовательности у АГЦ1 можно выделить четыре

потенциальных Са -связывающих участка типа ЕР-Ьапс1, причем, по-видимому, только ЕР-2, ЕБ-З и ЕР-4 обладают способностью связывать Са2+. Важные для координирования Са2н положения 3 и 4 в Са‘+-связывающей петле участка ЕР-1 заняты цистеином и пролином, соответственно, которые не могут принимать участия во взаимодействии с лигандом [93]. 1М-концевой глицин АРЦ1 гетерогенно ацилирован остатком одной из жирных кислот С 14:0, С 14:1,