Структурированные участки нуклеиновых кислот - мишени для избирательного воздействия низкомолекулярных лигандов и олигонуклеотидов

• Автор: Демченко, Юлия Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 123 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ -ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДСТВА БОРЬБЫ С ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ
1.1. Введение
1.2. Структура, химический состав и функции клеточной стенки прокариот
1.3. Барьерные функции клеточных стенок бактерий
1.3.1. Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий
1.3.2. Микобактериальная клеточная стенка
1.4. Методы доставки антисмысловых олигонуклеотидов и их производных в клетки бактерий
1.4.1. Использование липосом в качестве средства доставки олигонуклеотидов
1.4.2. Использование ПИК и пептид-ПНК конъюгатов для подавления роста бактериальных клеток
1.4.3. Доставка олигонуклеотидов и юг производных в клетки микобактерий
1.5. Выбор РНК-мишеней для подавления роста и жизнедеятельности бактерий с помощью антисмысловых олигонуклеотидов и их производных
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.2. Олигонуклеотиды
2.3. Методы
2.3.1. Введение 32Рметки по 5'-концевому положению олигонуклеотидов
2.3.2. Модификация ДНК диэтилпирокарбонатом
2.3.3. Модификация ДНК КМпО4
2.3.4. Гидролиз ДНК эндонуклеазой
2.3.5. Гидролиз ДНКрестриктазой ВатН1
2.3.6. Фотомодификация ДНК-мишени
2.3.7. Получение РНК с помощью реакции транскрипции in vitro
2.3.8. Выделение рибосом и рибосомных субчастиц из М. smegmatis и E. coli
2.3.9. Гибридизация олигонуклеотидов с РНК-транскриптом
2.3.10. Гибридизация олигонуклеотидов с 23SрРНК в составе рибосом и рибосомных субчастиц
2.3.11. Синтез дипептида Phe-Phe на рибосомах
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Структурная подвижность шпилечного ДНК-элемента, расположенного в U3
ОБЛАСТИ ДЛИННЫХ КОНЦЕВЫХ ПОВТОРОВ 1731 РЕТРОТРАНСПОЗОНА DROSOPHILA MELANOGASTER
3.1.1. Исследование вторичной структуры фрагментов Вс и комплементарного ему Впс
3.1.2. Анализ структуры Вс с помощью макроциклов, созданных на основе акридина
3.2. Исследование влияния образования комплексов олигонуклеотидов со ШПИЛЕЧНОЙ ДНК-МИШЕНЬЮ НА СТРУКТУРНУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ БЛИЗЛЕЖАЩИХ ОБЛАСТЕЙ ДНК
3.2.1. Антисмысловые олигонуклеотиды модулируют расщепление комплекса 69T-OL7рестриктазой BamHI
3.2.2. 3 '-Область 69Т-мишени взаимодействует с ее 5 ’-областью
3.2.3. Комплекс OL1-69T-OL7 образуется с участием несовершенных триплексов
3.2.4. 5 ’-Область OL5 взаимодействует с мишенью 69Т
3.3. Повышение специфичности связывания антисмысловых олигонуклеотидов при использовании в качестве мишени РНК-шпилек
3.3.1. Олигонуклеотиды способны специфично связываться с областью а-сарциновой петли 23S рРНК М. tuberculosis
3.3.2. Взаимодействие олигонуклеотидов с 70S рибосомами М. smegmatis и Е. coli, и влияние их на функциональную активность рибосом
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
№вВЕ - фактор, связывающий одноцепочечные участки ДНК
Мс1 - бис-акридиновый макроцикл
Мс2 - трис-акридиновый макроцикл
ПНК - пептидилнуклеиновая кислота
ПААГ - полиакриламидный гель
ТЕМЕ!) -И,N. И', К’, - тетраметилэтилендиамин
Трис - трис-гидроксиметил аминометан
ЕБТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
БЕРС - диэтилпирокарбонат
1)М8 - диметилсульфат
А260 - оптическое поглощение раствора на длине волны 260 нм е.а. - единица активности
Префикс “б” при написании структуры олигодезоксирибонуклеотидов, нуклеотидных пар и мономерных звеньев дезокси- ряда для краткости написания опущен.
2.3.8. Выделение рибосом и рибосомных субчастиц из М. smegmatis и Е
Культуру М. smegmatis выращивали в средах LB или Middlebrook с добавлением 5% Tween-80 в течение 48 ч при 30°С при аэрации. Клетки собирали центрифугированием (4000 об/мин) в течение 20 мин, дважды промывали буфером, содержащим 10 мМ Tris-HCl, pH 7.4, 60 мМ NH4CI, 14 мМ MgCl2, 6 мМ Р-меркаптоэтанол и суспендировали в этом же буфере. Клетки разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т, озвучивание проводили 8 раз по 30 сек при 4°С [163]. Клетки после озвучивания центрифугировали 12000 об/мин, 40 мин, 4“С (ротор JA-20, “Beckman” J2-21M), рибосомы из лизата клеток осаждали центрифугированием на 60000 об/мин, 2 ч, 4°С (ротор SW-27, “Beckman” L8-70M). Осадок рибосом растворяли в 200 мкл буфера связывания (20 мМ Tris-HCl, pH 7.4, 100 мМ N114CI, 20 мМ MgCh). Для получения 30S и 50S субчастиц, рибосомы наносили на линейный градиент плотности сахарозы 10%-30% в буфере диссоциации (20 мМ Tris-HCl, pH 7.4, 200 мМ NH4C1, 0.5 мМ MgCl2) и центрифугировали при 4°С, 24000 об/мин, 18 ч (ротор SW-27, “Beckman” L8-70M). Градиент раскапывали через проточную кювету спектрофотометра, пики соответствующие 30S и 50S субчастицам рибосом собирали и осаждали этанолом. Концентрацию рибосом и субчастиц определяли спектрофотометрически по поглощению на Х= 260 нм.
Е. coli штамм MRJE-600 выращивали в среде LB 16 ч при 37°С при сильной аэрации. Клетки собирали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин и дважды промывали буфером, содержащим 10 мМ Tris-HCl, pH 7.4, 60 мМ NH4CI, 14 мМ MgCl2, 6 мМ Р-меркаптоэтанол. Клетки разрушали растиранием с AI2O3 в этом же буфере [164]. Далее рибосомы и рибосомные субчастицы выделяли так же, как и в случае рибосом М. smegmatis.