Роль глутаматных рецепторов и энергетического обмена в токсичности аммиака

• Автор: Венедиктова, Наталия Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ
1.1. Природа аммиака
1.2. Источники аммиака в организме
1.3. Выведение аммиака из организма
1.4. Цикл и биосинтез мочевины
1.5. Тканевое распределение ферментов цикла мочевины
1.6. Другие ферменты, тесно сопряженные с циклом мочевины
1.7. Обмен аммиака в мозге IО
1.8. Обмен аммиака в сердце
1.9. Стационарные уровни аммиака в тканях
1.10. Нарушения в обмене аммиака. Гипераммонемия
1.11. Причины гипераммонемии
1.12. Токсичность аммиака
1.13. Влияние аммиака на энергетический обмен
1.14. Окислительный стресс при действии аммиака
1.15. Действие гипераммонемии на глутаматные рецепторы
1.16. Г ипераммонемия, NMD А-рецепторы и перекисные процессы
1.17. NMDА-рецепторы и гомеостаз кальция
1.18. Аммиак, NMDA-рецепторы и энергетический обмен в клеточном ядре
1.19. Цель и задачи исследования
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
3.1. Концентрация аммиака в тканях при острой аммиачной интоксикации
3.2. Влияние аммиака на ферменты, участвующие в обмене аммиака
3.3. Влияние аммиака на окислительное фосфорилирование
3.4. Влияние аммиака на содержание адениновых нуклеотидов
3.5. Действие аммиака на транспорт кальция в несинаптических митохондриях мозга крысы
3.6. Роль аммиака в развитии окислительного стресса
3.7. Поли(АДФ-рибозо)полимераза, НАД-синтетаза,НАД-гликогидролаза, уровень НАД1' и супероксидного радикала в ядрах мозга
при гипераммонемии
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. Обзор литературных данных
1.1. Природа аммиака
Аммиак - это природное соединение, которое оказывает влияние на все жизненно важные процессы в животных, растительных клетках и у микроорганизмов. Он является основным участником азотистого обмена, предшественником аминокислот, белков, пиримидиновых и пуриновых нуклеотидов, нейромедиаторов.
В обычных условиях этот газ встречается в небольших количествах в воздухе, речной и морской воде, почве, особенно в тех местах, где происходит разложение органических азотсодержащих веществ.
Аммиак и его производные находят широкое применение в химических лабораториях, в медицинской практике, в сельском хозяйстве и быту. Однако в избыточном количестве аммиак опасен. Он вызывает поражение глаз и дыхательных путей, тошноту, головную боль и в тяжелых случаях - судороги, коматозное состояние и летальный исход. Токсичность аммиака известна более 100 лет - с работ И. Павлова. Однако молекулярные механизмы токсического действия аммиака не выяснены.
1.2. Источники аммиака в организме
В физиологических условиях аммиак постоянно продуцируется во всех тканях организма. Важным местом образования этого вещества считается кишечник; у млекопитающих в брыжеечную вену выделяется 0,16 ммоля аммиака в час на 1 кг массы тела (Windmueller, 1980; Haussinger & Gerok, 1986). Глутамин - основной энергетический субстрат в эпителиальных клетках слизистой оболочки кишечника (Krebs 1980; Windmueller 1984; Souba, 1991), окисляется в глутаминазной реакции с высвобождением амидного азота в виде аммиака:
L-глутамин + Н20 -> L-глутамат + NH3.
Около 20-40% аммиака образуется в кишечнике при гидролизе мочевины под действием бактериальной уреазы (Haussinger & Gerok, 1986; Wrong et al., 1981; Murakami et al., 1995). Еще одним источником аммиака в кишечнике являются пищевые белки, которые расщепляются под действием бактерий (Dawson, 1978; Visek, 1979).
Из почек в кровь тоже может выделяться приблизительно 1 ммоль аммиака в час как в норме (Tizianello et al., 1980), так и в патологических условиях.
В скелетной (и сердечной) мышце аммиак образуется при физической нагрузке. Выделены три пути, по которым аммиак образуется в мышце, в зависимости от интенсивности и продолжительности упражнений (Graham, 1994):
1. дезаминирование АМФ (при короткой (несколько минут), но интенсивной, аэробной
физической нагрузке):

АТФ -> АДФ + Pi 2АДФ -» АТФ + АМФ АМФ -> ИМФ + NH3
В сердечной мышце этот процесс происходит в условиях ишемии (Hacker, 1992);
2. пуриновый нуклеотидный цикл (более длительные и умеренно интенсивные, аэробные упражнения) (Broberg & Sahlin, 1989):
Аспартат + ИМФ + ГТФ -> ГДФ + Pi + S-АМФ S-АМФ —> Фумарат + АМФ АМФ -> ИМФ + NH3 Некоторые авторы считают, что основным источниом аммиака в мышцах является пуриновый цикл (Lowenstein, 1972; Banister et al., 1983);
3. дезаминирование аминокислот с разветвленной боковой цепью (длительная аэробная физическая нагрузка) (Wagenmakers et al., 1990; Rush et al., 1993).
В мозге протекают по крайней мере 16 ферментативных реакций, в результате которых образуется аммиак: при распаде дофамина, адреналина, норадреналина, серотонина, при обмене аспартата, гуанина, гуанозина, аспарагина и т. д. Среди них выделяют три основных: глутаминазная и глутаматдегидрогеназая реакции и пуриновый нуклеотидный цикл, в которых источниками аммиака служат глутамин, глутамат и аспартат (Cooper & Plum, 1987).
1.3. Выведение аммиака из организма
Образующийся в организме аммиак непрерывно удатяется. В процессе эволюции у разных видов животных в зависимости от условий жизнеобитания сформироватись разные биохимические пути образования экскретируемых конечных продуктов азотистого обмена. Большинство позвоночных - млекопитающие, амфибии (во взрослом состоянии), хрящевые рыбы - образуют группу уреотелических животных; основным конечным продуктом азотистого обмена у них является хорошо растворимая в воде мочевина (urea в переводе с англ. - мочевина). Птицы и наземные пресмыкающиеся потребляют ограниченное количество воды, у летающих птиц она создает перегрузку массы, наземные рептилии обитают часто в засушливых местах. У них моча представляет собой полужидкую массу, содержащую кристаллы плохо растворимой в воде мочевой кислоты. Такие организмы называют урикотелическшш (от английских слов uric acid - мочевая кислота). Кроме птиц и наземных рептилий, к ним относятся насекомые. У некоторых видов аммиак выводится в форме аммонийного иона или еще одного продукта пуринового обмена - гуанина. Более общим термином - пуринотелическиии — называют тех животных, у которых выделяется преимущественно мочевая кислота либо другой пурин - гуанин.

высокими скоростями, чем митохондрии мозга крыс с острой гипераммонемией; У3 при окислении субстратов снижалась при гипераммонемии на 50% и 30%, соответственно. Гипераммонемия не изменяла скорость окисления этих субстратов в состоянии 4 (У4), но вызывала уменьшение КДК в 1,7 раза на пирувате с манатом и в 1,5 раза на сукцинате.
Таблица 6. Влияние острой шпераммонемии у крыс на показатели окислительного фосфорилирования в несинаптических митохондриях мозга.
Группы животных Субстраты Состояние 3 Состояние 4 КДК АДФ/О
Пируват +малат 70±7 17±4 4,1+0,9 2,8±0,1
Контроль Сукцинат Сукцинат + 99±10 37±2 2,7±0,3 1,6±0,2
глутамат 127±16 47±5 2,7±0,1 2,7±0,1
Пируват^ малат 35±5* 14±4 2,4+0,1* 2,4±0,2
Чувствительные к аммиаку Сукцинат Сукцинат + 69±5* 39±6 1,8±0,4* 1,8±0,2
глутамат 87±11* 44±7 1,9±0,2* 2,5±0,1
Пируват+ малат 69±2 17±3 4,0+0,2 2,7±0,2
Резистентные к аммиаку Сукцинат Сукцинат + 75±22 23±6* 3,2±0,9 1,8±0,2
глутамат 120±20 45±7 2,7±0,2 2,6±0,2
Скорости (Уз и У4) - в нг-ат О/мин на 1 мг белка. *Р<0,05 при сравнении с контролем.
Поскольку известно, что окисление сукцината в митохондриях тормозится эндогенно образуемым оксалоацетатом (Кондрашова, 1969), мы исследовали способность митохондрий мозга и сердца к окислению сукцината в присутствии глутамата, который удаляет избыточный оксалоацетат трансаминированием. Как показано в таблицах 5 и 6, скорость окисления сукцината с глутаматом в состоянии 3 дыхания митохондрий выше, чем скорость окисления одного сукцината. В наших опытах наличие ограничения окисления сукцината наблюдалось как в опытном, так и в контрольном препаратах мозга и сердца и составило 20-40%. Следует отметить, что часть крыс оказалась нечувствительной к токсическому действию аммиака. В митохондриях мозга таких крыс было также обнаружено оксалоацетатное торможение (Табл. 6); при этом скорость фосфорилирующего дыхания при окислении сукцината не отличалась от Уз для опытного препарата митохондрий. Дыхание митохондрий сердца опытных крыс в состоянии 3 при использовании одного сукцината не изменялось по сравнению с дыханием контольного препарата.
Добавление глутамата в среду инкубации контрольного и опытного препаратов митохондрий мозга, содержащую сукцинат, увеличиваю У3 почти в равной степени: скорость дыхания митохондрий мозга контрольных, опытных и резистентных животных при окислении сукцината с глутаматом в состоянии 3 увеличилась почти в 1,6 раза