Очистка, характеристика, расщепление оксоглута-ратдегидрогеназного комплекса из надпочечников быка и свойства его периферических ферментов

• Автор: Таранда, Николай Иванович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Гродно
• Количество страниц: 167 c. : ил

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Структура и механизм действия ОГДК
1.2. Кинетические и регуляторные свойства оксоглутарат-дегидрогеназных комплексов и их ОГД-компонентов из различных источников
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБОСНОВАНИЕ ТЕМЫ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ . . ...
ГЛАВА 3. ОЧИСТКА И ОБЩИЕ СВОЙСТВА ОКСОГЛУТАРАТДЕГЙДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ БЫКА
3.1. Выделение и очистка ОГДК
3.2. Данные о гомогенности и субъединичном составе
ОГДК
3.3. Оптимальные условия для протекания реакций ОГДК
3.4. Температурная зависимость, термостабильность ОГДК .
ГЛАВА 4. СТАЦИОНАРНАЯ КИНЕТИКА РЕАКЦИЙ, КАТАЛИЗИРУЕМЫХ ОГДК ИЗ КОРЫ НАДПОЧЕЧНИКОВ . . .
4.1. Зависимость скорости оксогл^таратдегидрогеназной реакции от концентрации 2-оксоглутарата, КоА и НАД+
4.2. Выяснение общего кинетического механизма ОГДК
4.3. Ингибирование ОГДК продуктами его реакций
4.4. Ионы фосфата и двухвалентных металлов в обеспечении активности ОГДК
4.5. Роль АТФ в регуляции оксоглутаратдегидрогеназного
комплекса надпочечников
ГЛАВА 5. РАСЩЕПЛЕНИЕ ОГДК НА ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ
5.1. Применение протеазы из почек быка для расщепления ОГДК
5.2. Протеолитическое действие папаина на оксоглутаратде-гидрогеназный комплекс из коры надпочечников быка
5.3. Хроматография на геле фосфата кальция в сочетании с
лимитированным протеолизом папаином
ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ И РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ 0КС0ГЛУТАРАТДЕГИДР0ГЕНАЗЫ В РЕАКЦИИ С ДХФИФ
6.1. Особенности модельной реакции и ее кинетического механизма
6.2. Активирующее влияние ДДФ на оксоглутаратдегидрогена-

6.3. Способы десенсибилизации оксоглутаратдегидрогеназы
к аденозиндифосфату
ГЛАВА 7. КИНЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЛИП0М1ИДДЕГИДР0ГЕНАЗН0Г0 КОМПОНЕНТА ОГДК
7.1. Прямая реакция, катализируемая изолированной и входящей в состав ОГДК липоамиддегидрогеназой, и ингибирование ее НАДН
7.2. Обратная липоамиддегидрогеназная реакция
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
выводы :
ЛИТЕРАТУРА
ДОКУМЕНТЫ О ВНЕДРЕНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ Аденозиндифосфат АДФ
Аденозинмонофосфат АМФ
Аденозинтрифосфат АТФ
2,6-дихлорфенолиндофенол и ДХФИФ
его восстановленная форма ДХФИФ*Н£
Коэнзим А КоА
Липоамиддегидрогеназа ЛДГ (Е3)
Липоатацетилтрансфераза ЛАТ
Липоатеукцинилтрансфераза ЛСТ (Е^)
Липоевая кислота ЛипБ £
Никотинамидадениндинуклеотид НАД+
и его восстановленная форма НАДН
Оксоглутаратдегидрогеназный комплекс ОГДК
2-оксоглутаровая кислота 2-ОГ
Пируватдегидрогеназный комплекс ПДК
и собственно пируватдегидрогеназа ПД
Электрофорез в додецилсульфат
полиакриламидном геле ДЦС-ПААГ
Собственно оксоглутаратдегидрогеназа ОГД (Е^)
Тиаминдифосфат ТДФ
Кальций фосфатный гель на целлюлозе КФГЦ
Трис-(оксиметил)-аминометан ТрисФлавинадениндинуклеотид и ФАД
его восстановленная форма ФАД*Н£
Фосфат неорганический Фн
Этилендиаминтетраацетат ЭДТА

Следует отметить, что разделение ЦЦК и ОГДК из сердечной мышцы при помощи фракционирования полиэтиленгликолем происходило более четко (Linn, Pelley, Pettit et al., 1972). При получении ОГДК из сердца быка мы наблюдали также, что ПДК из раствора ферментов на 0,05 М калий-фосфатном буфере (pH 6,5) осаждается при 20000 g даже без добавления полиэтиленгликоля. ОГДК же весь остается в надосадочной жидкости. Таким образом, уже на этой стадии очистки происходит значительное разделение сердечных ОГДК и ПДК.
В случае надпочечниковых комплексов нужны были дополнительные стадии очистки для их разделения. Следующим этапом мы использовали ультрацентрифугирование через слой сахарозы, при котором фермент освобождался от ниэкомолекулярных белков. Но эта стадия .. не способствовала отделению от ОГДК пируватдегидрогеназного комплекса, который наоборот осаждался несколько быстрее ОГДК
Значительные потери выделяемого комплекса наблюдались в процессе осаждения его при pH от 6,0 до 5,3. Применение изоэлек-трического осаждения приводило к удалению при pH 6,0 значительного количества постороннего белка, в том числе и ПДК, который при этом pH осаждался раньше ОГДК. Данная стадия требует большой осторожности в связи с тем, что при более сильном подкисле-нии происходит инактивация фермента. Отчетливой изоэлектричес-кой тачки для ОГД-комплекса не было обнаружено, вероятно потому, что варьировало содержание отдельных компонентов в молекуле • Хорошей очистки, при небольших потерях, удалось добиться на следующем этапе, применив гель-фильтрацию через сефарозу 4В,
которая обладает разделяющей способностью в диапазоне молеку-

лярных весов 3*10 - 2-10 (Чоупек, Кубин, Дейл, 1978) . Позже, при очистке комплекса, мы успешно использовали сефарозу 2В.