Функционирование НАДФ-изоцитратдегидрогеназы и аконитатгидратазы в миокарде крысы в условиях активации свободнорадикального окисления при ишемии

• Автор: Медведева, Лилия Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Воронеж
• Количество страниц: 250 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Этиологические факторы ишемии миокарда и её основные формы
1.2. Особенности метаболизма миокарда в условиях нормы и ишемии
1.2.1. Общая характеристика метаболизма кардиомиоцитов в норме
1.2.2. Характеристика изменений метаболизма миокарда при ишемии
1.3. Изменения ультраструктурной организации кардиомиоцитов при ишемии
1.4. Активные формы кислорода в метаболизме миокарда в норме и при ишемии
1.4.1. Активные формы кислорода и источники их генерации в миокарде
1.4.2. Роль активных форм кислорода в инициации пероксиднош окисления липидов
1.4.3. Механизмы образования активных форм кислорода в патогенезе ишемии
1.4.4. Значение активных форм кислорода в метаболизме миокарда
1.4.5. Регуляция образования активных форм кислорода. Характеристика некоторых типов антиоксидантных и прооксидангных систем миокарда
1.5. Аконитатгидратаза
1.5.1. Структурно-функциональные свойства аконитатгидратазы
1.5.1.1. Катализируемая реакция
1.5.1.2. Изоформы и внутриклеточная локализация
1.5.1.3. Участие в метаболических процессах миокарда
1.5.1.4. Молекулярная масса и структура аконитатгидратазы
1.5.2. Очистка и физико-химические свойства аконитатгидратазы
1.5.2.1. Способы выделения и очистки аконитатгидратазы
1.5.2.2. Спектральные свойства аконитатгидратазы
1.5.3. Кинетические и регуляторные свойства
1.5.3.1. Кинетические параметры каталитического действия
1.5.3.2. Регуляция активности аконитатгидратазы
1.6. НАДФ-изоцитратдегидрогеназа
1.6.1. Структурно-функционалыгые свойства МАДФ-изоцитратдегидрогеназы
1.6.1.1. Катализируемая реакция и функции
1.6.1.2. Множественные молекулярные формы
1.6.1.3. Выделение и очистка НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
1.6.1.4. Молекулярная масса и структура
1.6.2. Кинетическое поведение и регуляция активности
1.6.2.1. Влияние температуры и pH среды
1.6.2.2. Кинетические параметры каталитического действия
1.6.2.3. Регуляторные свойства НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Методы исследования
2.2.1. Моделирование экспериментальной ишемии миокарда у крыс
2.2.2. Выделение субклеточных органелл из сердца крыс
2.2.3. Оценка оксидативного статуса клеточных органелл миокарда крыс
2.2.3.1. Оценка интенсивности свободнорадикальных процессов и антиокси-дантной активности миокарда методом хемилюминесцеции
2.2.3.2. Определение интенсивности процессов пероксидного окисления липидов спектрофотометрическим методом
2.2.3.3. Определение концентрации «-токоферола
2.2.3.4. Определение концентрации цитрата
2.2.4. Определение активности ферментов
2.2.5. Определение количества белка
2.2.6. Выделение и очистка изоформ аконитатгидратазы и НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из субклеточных фракций миокарда крыс в норме и при ишемии
2.2.6.1. Фракционирование сульфатом аммония
2.2.6.2. Гель-фильтрационная хроматография
2.2.6.3. Ионообменная хроматография
2.2.7. Аналитический электрофорез
22.8. Определение молекулярной массы
2.2.9. Исследование физико-химических, кинетических характеристик и регуляции активности ферментов в условиях нормы и ишемии
2.2.10. Статистическая обработка данных
ГЛАВА 3. ОЦЕНКА ОКСИДАТИВНОГО СТАТУСА МИОКАРДА КРЫС В НОРМЕ
И ПРИ ИШЕМИИ
ГЛАВА 4. АКТИВНОСТЬ И СУБКЛЕТОЧНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ И НАДФ-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В КАРДИОМИОЦИТАХ КРЫС В УСЛОВИЯХ НОРМЫ И ИШЕМИИ
4.1. Исследование субклеточной локализации ферментов
4.2. Исследование изоферментного спектра аконитатгидратазы и НАДФ-
изоцитратдегидрогеназы методом электрофореза в полиакриламидном геле
ГЛАВА 5. ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОФОРМ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ И НАДФ-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ НОРМАЛЬНОГО И ПОДВЕРГНУТОГО ИШЕМИИ МИОКАРДА КРЫС
5.1. Очистка и разделение изоформ аконитатгидратазы и НАДФ-изоцитратдегидрогеназы из цитоплазматической и митохондриальной фракций миокарда контрольных и подвергнутых ишемии крыс
5.2. Физико-химические свойства
52.1. Молекулярная масса
5.2.2. Спектральные свойства
52.3. Исследование термостабильности аконитатгидратазы и НАДФ-
изоцитратдегидрогеназы в норме и при ишемии
ГЛАВА 6. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КИНЕТИЧЕСКИХ И РЕГУЛЯТОРНЫХ СВОЙСТВ АКОНИТАТГИДРАТАЗЫ И НАДФ-ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В УСЛОВИЯХ НОРМЫ И ИШЕМИИ
6.1. Кинетические параметры каталитического действия
6.1.1. Влияние концентрации субстратов и кофакторов на скорость реакций, катализируемых аконитатгидратазой и НАДФ-изоцитратдегидрогеназой
6.1.2. Влияние pH на активность аконитатгидратазы и НАДФ-изоцитратдегидрогеназы
6.1.3. Влияние температуры на активность ферментов

ГТТ в поддержании стационарного уровня Н2О2 /101/. При невысоких концентрациях Н2(>2 изменяется активность ГП и соотношение НАДФН/НАДФ в цитозоле, при увеличении НА окисляется НАДН и активируется ГП в митохондриях /165/.
а-Такоферат - основной эндогенный антиоксидант организма млекопитающих, имеющий наиболее высокую константу взаимодействия с первичными АФК и предотвращающий развитие неферментативного ПОЛ на стадии разветвления цепи /174/. В норме а-токоферол участвует в поддержании структурной целостности и регуляции проницаемости мембран, биосинтезе белков на уровне транскрипции, метаболизме углеводов, жиров и некоторых микроэлементов (2!л2+, Са2", Бе), а также в регуляции редокс-потенциала клетки /198/. В частности, а-токоферолу отводится важная роль в предохранении от окисления негеминового Ре2+ и Со(^ митохондрий. АОА 01-токоферола связывают с его способностью к рекомбинации с '02, 02**, ШЭ2* и ЛООП /173/. Считается, что свои ашиоксидантные функции а-токоферол осуществляет путём локального разрушения АФК в участках функционирования белков Э Щ или создания компактной мембранной архитектуры, стерически предотвращающей атаку АФК на ПНЖК. Наиболее оптимальной для размещения углеводородной цепи а-токоферола является пространственная конфигурация арахидоновой кислоты, имеющей 4 цис-ненасыщенные связи. СНз-группы боковой цепи а-токоферола упаковываются в “карманы”, образованные двойными связями кислоты, стабилизируясь за счёт ван-дер-ваальсовых связей, а ОН-группа располагается на поверхности мембраны /116/. Взаимодействие а-токоферола с АФК в липидной фазе мембран включает эстафетную передачу и акцетирование АФК на боковой цепи антиоксиданта и реорганизацию 01Г-центра с образованием нереакционноспособного феноксирадикапа. Методом

хемилюминесценции показано, что а-токоферол ингибирует СЮ в концентрациях 10' -10"8 М при соотношении с молекулами фосфолипидов 1:4000 /175/.
1Ьопр<мп в клетках миокарда крыс содержится в основном в цитоплазме, где его концентрация составляет 0,258 рМ/г ткани /199/. По-видимому, это связано с низкой способностью митохондрий сердца к аккумуляции и транспорту цитрата /200/. Перенос цитрата через митохондриальную мембрану осуществляется системой трикарбоксилатов и сопряжён с переносом малата. Считается, что транспорт цитрата в кардиомиоцитах крысы определяется процессами протонирования-депротонирования белка-переносчика наружной и внутренней митохондриальной мембраны с Умах 6,