Экспрессия маркеров клеток-предшественников и факторов ангиогенеза стромальными клетками жировой ткани

• Автор: Трактуев, Дмитрий Олегович
• Шифр специальности: 03.00.04, 14.00.06
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Список сокращений
Обзор литературы
Концепция роста и развития сосудистой сети
Васкулогенез. Предшественники эндотелиальных клеток
Гипоксия - механизм запуска ангиогенеза
Ангиогенез. Стабилизация стенки сосуда
Артериогенез. Ремоделирование стенки сосуда
Лейкоциты и тромбоциты в ангиогенезе
Протеазы в ангиогенезе и артериогенезе
Генная терапия
Генетические векторы
Факторы, используемые для стимуляции аигиогенеза
Клетки организма как основа клеточной терапии
Представление о терапевтическом воздействии клеток
Эмбриональные стволовые клетки
Моноядерные клетки костного мозга
Мезенхимальные стволовые клетки
Предшественнники эндотелиальных клеток
Миобласты
Зрелые дифференцированные клетки взрослого организма
Стромальные клетки жировой ткани
Нейрональная дифференциация
Дифференциация СКЖТ в клетки соединительной ткани
Дифференциация СКЖТ в жировую ткань
Дифференциация СКЖТ в костную ткань
Дифференциация СКЖТ в хрящевую ткань
Дифференциация СКЖТ в миогенную ткань
Дифференциация СКЖТ в кардиомиоциты
Клональный анализ клеток СКЖТ
СКЖТ и гематопоэз
Материал и методы исследования
Эксперименты с культурами клеток
Выделение стромальных клеток жировой ткани
Выделение клеток из жировой ткани человека
Выделение клеток из жирового отложения мыши
Культивирование СКЖТ
Анализ экспрессии антигенов на поверхности клеток
Культивирование СКЖТ человека в условиях гипоксии
Анализ способности СКЖТ человека к адипоцитарной дифференциации
Молекулярные и биохимические эксперименты
Анализ накопления факторов, секретируемых СКЖТ человека,
в среде культивирования

Определение активности бета-галактозидазы
Анализ экспрессии мРНК СКЖТ человека
Выделение РНК
Реакция обратной транскрипции и полимеразно-цепная реакция
в реальном времени
Анализ влияния среды культивирования СКЖТ человека на рост ЭК
Трансфекция СКЖТ человека
Плазмидная трансфекция клеток
Трансфекция клеток аденовирусом
Трансфекция клеток лентивирусом
Эксперименты на животных
Имплантация чСКЖТ в матригеле
Оценка выживаемости и миграции клеток
Модель ишемии нижней конечности мыши и трансплантация СКЖТ
Измерение кровотока
Иммуногистохимический анализ
Подготовка тканей
Детектирование антигена мыши СПЗ 1 на срезах мышц и матригелей
Детектирование антигенов человека СЭ31 и С034 на срезах жировой ткани
и щитовидной железы
Подсчет капилляров
Статистическая обработка данных
Результаты исследования
Выделение и культивирование СКЖТ человека
Выделение и культивирование СКЖТ мыши
Экспрессия антигенов на поверхности СКЖТ человека
Экспрессия антигенов на поверхности СКЖТ мыши
Влияние среды культивирования СКЖТ человека на способность клеток к адипоцитарной дифференциации
Экспрессия факторов роста СКЖТ человека
Влияние среды культивирования СКЖТ человека на пролиферацию эндотелиальных клеток
Развитие сосудистой сети в клеточном имплантате
Влияние системного введения СКЖТ человека на ангиогенез и восстановление кровотока в конечности мыши
Анализ эффективности трансфекции СКЖТ человека
Оценка выживания и миграции в мышечной ткани локально введенных чСКЖТ
Анализ влияния высокалорийной диеты на аккумуляцию СКЖТ в жировой ткани мыши
Обсуждение результатов
СКЖТ: анализ антигенов
Влияние диеты на аккумуляцию СКЖТ
Терапевтический потенциал СКЖТ
Повышение терапевтического эффекта СКЖТ
Возможные побочные эффекты использования СКЖТ
Выводы
Список литературы

Модель ишемии нижней конечности мыши и трансплантация СКЖТ
Для экспериментов на модели ишемии нижней конечности мыши использовали самцов 8-12 месячного возраста линии Nude (Harlan). Операции проводили в асептических условиях под ламинаром с положительным давлением воздуха. Перед операцией животных анестезировали 2,5% авертином из расчета 10 мл/кг веса.
На коже средней части левого бедра делали продольный разрез длиной 8 мм, после чего соединительную и жировую ткань расчищали в стороны от пучка бедренной артерии, вены и нерва. Выделяли бедренную артерию, а также все ее веточки, после чего артерию перевязывали в области паховой связки сверху и снизу после бифуркации ее на подкожную и подколенную артерии. Все веточки артерии, находящиеся между основными лигатурами, также перевязывали, после чего сосуд вырезали. По окончании операции кожу на бедре зашивали. Для перевязки сосудов использовали шелковую нить 6-0, а для зашивания кожи - абсорбирующуюся нить Vicryl 4-0.
На следующий день после проведения операции, непосредственно после проведения первого измерения кровотока (базальный кровоток), мышам через хвостовую вену вводили в 200 мкл среды ЕВМ/5%ЭСБ 5х105 чСКЖТ 2 типов: 1) свежевыделенные, предкультивированные на пластике в течение 18 часов в среде EGM-2mv; 2) клетки 1 пассажа, культивированные в среде EGM-2mv.
Измерение кровотока
Влияние введенных клеток на стимуляцию ангиогенеза оценивали по восстановлению кровотока в подошвенной области лапы мышей. Для оценки кровотока использовали лазер-допплеровский имиджер (Laser Doppler Imaging System, Moor, Великобритания) по модифицированной нами методике Т. Couffmhal [251].
В приборе используется инфракрасный лазер 2,5 мВт, генерирующий луч света, способный проникать на глубину до 1 мм. Метод измерения кровотока основан на том, что, в соответствии с принципом Допплера, клетки крови, «протекающие» в сосуде, вызывают сдвиг частоты испускаемого света, который и фиксируется прибором.
Измерения кровотока проводили на 1-ый, 5-ый и 10-ый день после проведения операции. Животное анестезировали газовой смесыо 1,5% изофлорана/02 и поддерживали на этой анестезии в течение всего измерения. Животное помещали на матрас с поверхностной температурой 37-38 °С, и до начала сканирования выдерживали минимум 10 мин при этих условиях. В обработку включались данные, полученные при условии, что разница в результатах трех последовательных измерений, проведенных с интервалом в 2 минуты, не превышала 5%.