Программированная клеточная смерть у растений: роль хлоропластов

• Автор: Лагунова, Елена Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с.

Список ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
1. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Становление представлений о клеточной смерти. Типы клеточной смерти
2.2. Механизмы ПКС
2.2.1. Роль протеаз
2.2.2. Роль эндонуклеаз
2.2.3. Участие протеинкиназ
23. АФК и их роль в ПКС
2.4. Роль митохондрий в ПКС
2.4.1. Митохондрии как АФК-генерирующие системы
2.4.2. Митохондрии как поставщики апоптогенных факторов
2.5. Хлоропласты как энергопреобразующие и сигналпередающие системы. Косвенные данные об участии хлоропластов в ПКС
2.5.1. Фотосинтетическая электронтранспортная цепь. Общие представления
2.5.2. Хлоропласты как АФК-генерирующие системы
2.5.3. Р0-зависимые ПК хлоропластов
2.5.4. Косвенные данные об участии хлоропластов в ПКС
2.6. Акцепторы электронов фотосинтетической ЭТЦ и игибиторы электронного транспорта
2.7. Модели для изучения ПКС у растений
3. Экспериментальная часть
3.1. Цель и задачи исследования
3.2. Объекты и методы исследования
3.2.1. Исходные сорта и мутаны гороха, использованные в работе
3.2.2. Проращивание гороха и выделение абаксиального эпидермиса листа
3.2.3. ЭПР-спектроскопия
3.2.4. Оксиметрия
3.2.5. Спектрофотометрия
3.2.6. Кондуктометрия
3.2.7. Создание анаэробных условий
3.2.8. Приготовление гематоксилина Карацци
3.2.9. Инфильтрация реагентов
3.2.10. Условия инкубации с реагентами
3.2.11. Окрашивание препаратов, микроскопия и получение фотографий
3.2.12. Статистическая обработка данных
3.2.13. Обоснование экспериментальных подходов, использованных в работе
3.3. Результаты исследования
3.3.1. Подбор условий инкубации
3.3.2. Подбор режима инфильтрации
3.3.3. Проверка активности ферментов, используемых для создания анаэробных условий в среде инкубации
3.3.4. Кондуктометрические опыты
3.3.5. Влияние С19~на ядерный аппарат клеток эпидермиса из листьев гороха
3.3.6. Влияние освещения на СП“-индуцированное разрушение ядер в усть-ичных и эпидермальных клетках из листьев гороха
3.3.7. Влияние интенсивности света и его спектрального состава на С>Г-индуцированное разрушение ядер в устьичных клетках из листьев гороха
3.3.8. Влияние антиоксидантов и анаэробиоза на О'Г-индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса листьев гороха
3.3.9. Действие акцепторов электронов на ОГ-индуцированное разрушение клеточных ядер
3.3.10. Влияние ингибиторов фотосинтетического переноса электронов ИСМи, ПИР-ГМТ и стигмателлина на СИ--индуцированное разрушение ядер
3.3.11. Действие ингибиторов протеинкиназы С и протеаз
3.3.12. С]хГ-индуцированное разрушение ядер в клетках эпидермиса мутантов гороха
3.3.12.1. ЭПР-спекроскопия листьев гороха
3.3.12.2. Световая микроскопия устьичных клеток
3.3.12.3. Действие РСМи и метилвиологена на ОГ-индуцированный апоптоз устьичных клеток
3.4. Обсуждение результатов
3.5. Выводы
4. Литература
изучения морфологии и структуры клеточного ядра у животных и растений (Макаров и Сафронов, 1978; Барыкина и др., 2000). Краситель хорошо растворяется в горячей воде, этиловом спирте, глицерине.
Существуют различные способы приготовления этого красителя. Один из них — приготовление гематоксилина Карацци (Karacci), который использовался в нашей работе. При комнатной температуре смешивают 0,5 г гематоксилина, 25 г алюмокалиевых квасцов (KA1(S04)2 ‘^НгО), предварительно растертых в порошок в фарфоровой ступке, добавляют 100 мл глицерина (х. ч.) с 400 мл воды, затем 0,1 г KJ (Паушева, 1976). Приготовленный раствор помещали в колбу, горлышко которой прикрывали свернутой в несколько слоев марлей, и ставили под люминесцентную лампу (-1000 лк) для созревания. Через 2 недели раствор готов для применения.
3.2.9. Инфильтрация реагентов
Для обеспечения быстрого проникновения реагентов в клетки отделенного эпидермиса использовали метод инфильтрации путем инкубации эпидермальных пленок под вакуумом в течение 1-2 мин при давлении 8-10 мм рт.ст. Время было подобрано в опытах на проростках гороха (см. раздел 3.3.2). Метод вакуум-инфильтрации известен в литературе, широко распространен в биохимических и физиологических исследованиях на растительных объектах (Bechtold and Pelletier, 1998; Ye et al., 1999; Vanholme et al., 2002).
3.2.10. Условия инкубации с реагентами
Образцы инкубировали с реагентами, состав которых приведен в подписях к рисункам, при комнатной температуре в темноте либо под люминесцентной лампой при интенсивности света -1000 лк. Для опытов по влиянию интенсивности света на СБТ-индуцированное разрушение ядер использовали металлические сетки в качестве оптически нейтральных фильтров с различной степенью светопропускания, предварительно измеренной с помощью спектрофотометра (см. раздел 3.2.5).
Зная, что в ответ на освещение в клетках растений кроме хлоропластов, могут реагировать также другие фоторецепторы - фитохромы (для активации которых требуется свет ?.тах 660 нм), в опыте использовали также красный светофильтр КС 18 (рис. 6).