Структурно-функциональные исследования активного центра бактериальной РНК-полимеразы

• Автор: Зоров, Савва Дмитриевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Актуальность проблемы
Цель работы и задачи исследования
Научная новизна
Практическое значение работы
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Общие сведения о РНК-полимеразе и
Транскрипционном цикле
1.2. Структурные особенности РНК-полимеразы
1.3. Структурно-функциональная модель активного центра РНК-полимеразы
1.3.1. Двуметаллический механизм катализа
1.3.2. Механизм катализа многосубъединичной РНКП
1.3.3. Характеристика реакции 3’-5’-экзонуклеазного
ра еще ппения
1.3.4. Влияние мутационных замен в ß-субъединице РНКП
E. coli на 3’-5’-экзонукпеазную активность
1.3.5. Молекулярное моделирование активного
центра РНКП E. Coli
1.4. Ингибиторы РНК-полимеразы. Антибиотики
1.4.1. Рифампицин
1.4.2. Тагетитоксин

1.4.3. Альфа-аманитин
1.4.4. Специфичность действия аманитина и тагетитоксина
1.4.5. Стрептолидиаин
1.4.6. Липиармицин
1.4.7. Микроцинй
1.4.8. Ингибиторы серии CBR
1.4.9. Дауномицин и марселломицин
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды
2.2. Полимеразы
2.3. Приготовление РНК-полимеразы из клеток
2.3.1. Выделение РНК-полимеразы E.coli
2.3.2. Выделение РНК-полимеразы Thermus aquaticus
2.4. Бактериальные среды
2.5. Электрофорез
2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.7. Метод Бе2+-индуцированного расщепления белка
2.8. Радиоактивное мечение олигонуклеотидов
2.9. Транскрипция с Т7А1 промотора, абортивный синтез
2.10. Транскрипция на искуственных транскрипционных
комплексах (нуклеиновокислотных скаффолдах)
2.11. Эндонуклеотическое и экзонуклеотическое
расщепление, пирофосфоролиз

2.12. Измерение быстрых кинетик реакции элонгации
2.13. Определение скоростей реакций (Kobs ,Vmax) и константы Михаэлиса (Кт)
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование механизма ингибирования бактериальной РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином
3.1.1. Стрептолидигин ингибирует присоединение нуклеотида, разделяя элонгационноые комплексы на медленную
и быструю фракции
3.1.2. Характеристика фракций элонгационных комплексов, образующихся в присутствии стрептолидигина
3.1.3. Стрептолидигин ингибирует внутреннее расщепление РНК, при этом также разделяя комплексы на медленную
и быструю фракции
3.1.4. Присутствие стрептолидигина не изменяет значение
Ки для входящего нуклеозидтрифосфата
3.1.5. Стрептолидигин замедляет некую стадию, предшедствующую синтезу фосфодиэфирной связи
3.1.6. Кристаллическая структура РНКП со связанным
с ней стрептолидигином. Модель ингибирования РНКП стрептолидигином и функционирования активного
центра РНКП
3.2. Изучение роли триады остатков аспарагиновой

Тагетитоксин препятствует развитию хлоропластов в молодых листьях растения, инфицированного этой бактерией, не влияя на общее состояние растения. Было показано, что этот эффект объясняется тем, что тагетитоксин ингибирует активность РНК-полимеразы хлоропластов, которая причисляется к классу эубактериальных полимераз. (Mathews and Durbin, 1990). РНК-полимераза E.coli тоже чувствительна к его действию. С другой стороны, РНК-полимеразы бактериофагов Т7 и SP6, а также РНКП II зародышей пшеницы устойчивы к тагетитоксину (Mathews and Durbin, 1990). В работе (Steinberg et al., 1990) исследовалось действие тагетитоксина на ядерные РНК-полимеразы различных организмов (человек, Xenopus, шелковичный ф червь, дрожжи). Было показано, что тагетитоксин селективно ингибирует
активность РНК-полимеразы III.
Более детально механизм действия тагетитоксина был изучен в ядерных экстрактах дрожжей (Steinberg and Burgess, 1992). На нескольких промоторах ставилась реакция одно- и многораундовой транскрипции. В присутствии тагетитоксина РНК-полимераза делала паузы или остановки в некоторых определенных и специфичных для каждой из использованных матриц точках. Эти остановки наблюдались после включения UMP в транскрипт. РНК в составе таких паузированных комплексов (изолированных из реакционной смеси, содержащей тагетитоксин) способны удлиняться, давая полноразмерный транскрипт. Возможно, тагетитоксин лишь усиливает естественные паузы в элонгации. Разный набор вызываемых тагетитоксином