Новая аспартатная протеиназа ретротранспозона Ulysses : Drosophila Virilis

• Автор: Волков, Денис Александрович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 95 с. : ил.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общая характеристика аспартатных протеиназ. 3 1.1.Основные принципы структурной организации аспартатных протеиназ
1.1.1. Трехмерная структура пепсина
1.1.2. Трехмерная структура протеиназы НІУ-1
1.3. Общая характеристика ретровирусных аспартатных протеиназ на примере протеиназы вируса иммунодефицита человека
1.3.1. Субстраты и субстратная специфичность
1.3.2. Механизм катализа и факторы, влияющие на каталитическую активность.

1.4. Протеиназы эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов
2. Общая характеристика мобильных генетических элементов
2.1. Транспозоны
2.2. Ретропозоны
2.3. Ретротранспозоны
2.3.1. Строение ретротранспозонов на примере соріа ВгозорМІа теїапоцавіег и
Ulysses Drosophila virilis
2.3.2. Жизненный цикл ретровирусов и ретротранспозонов
2.3.3. Влияние ретротранспозиций на геном хозяина
2.3.3.1. Негативное влияние
2.3.3.2. Залечивание двухцепочечных разрывов ДНК
2.3.3.3. Удлинение теломер
3. Теоритически-рассчетные методы исследования аспартатных протеиназ
ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1.0пределение локализации протеиназы Ulysses Drosophila virilis в составе полибелка-предшественника
2. Клонирование гена протеиназы Ulysses Drosophila virilis в плазмидном векторерЕТ-23а(+)
3.Экспрессия рекомбинантного гена. Очистка белка
4.Исследование свойств протеиназы Ulysses
4.1.Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки (pi)
4.2. Гидролиз мелиттина
4.3.Гидролиз В-цепи инсулина
4.4. Определение рН-оптимума
4.5. Ингибирование гидролиза В-цепи инсулина протеиназой Ulysses пепстатинам

4.6.Автолиз
5. Построение трехмерной модели протеиназы Ulysses
5.1. Моделирование трехмерной структуры
5.2. Молекулярно-динамическое моделирование пространственной структуры молекулы протеиназы Ulysses
5.3. Анализ третичной структуры
5.4.Междоменный слой
5.5. Анализ карманов связывания протеиназы Ulysses
5.6.Спектр флуоресценции
5.7. Круговой оптический дихроизм (КД)
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы
2. Методы исследования
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
2. Клонирование гена протеиназы Ulysses Drosophila virilis в плазмидном векторе рЕТ-23а(+).
Для получения рекомбинантной протеиназы соответствующий ген клонировали в плазмидном векторе рЕТ-23а(+). Фрагмент ДНК, кодирующий протеиназу, получали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя в качестве матрицы фрагмент гена ретротранспозона Ulysses, любезно предоставленный Евгеньевым М.ь. (институт молекулярной биологии им, В.А.Энгельгарда РАН). Для амплификации были использованы два олигонуклеотидных праймера: l-5'-AAAAACATATGGTGAGACGG GAG GAG AGT-3% содержащий нуклеотидную последовательность, соответствующую 5'-концу гена протеиназы. Праймер содержал на 5’-конце сайт узнавания рестриктазой
Ген протеиназы Ulysses, полученный в результате ПЦР
Nde I
Hind III
Nde I
Hind III
Лигирование
Рис. 13. Схема клонирования гена протеиназы из мобильного элемента Ulysses в плазмидном векторе рЕТ-23а(+).