Роль цитохром-b5-редуктазы и альдегидизомеразы в окислении мембранных липидов и метаболизме альдегидов

• Автор: Агаджанян, Зировард Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

Раздел I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Окислительный стресс
1.1 Активные формы кислорода: пути образования, основные
компоненты антиоксидантной системы
1.2. Этапы перекисного окисления фосфолипидов: МАЭРН зависимая электрон-транспортная цепь эндоплазматического ретикулума
Глава 2. ИАОН-зависимая электрон-транспортная цепь
2.1. Переносчики ЫАЭН-зависимой редокс-цепи
2.2. Реакции, катализируемые №ОН-цитохром-Ь5-редуктазой (десатурация и элонгация жирных кислот, синтез холестерина, плазмалогенов и церамида)
Глава 3. Природные альдегиды и их биологические функции.
Метаболизм альдегидов в клетках млекопитающих
3.1. Малоновый диальдегид. Текущие представления о малоновом диальдегиде как о токсичной молекуле
3.2. Метилглиоксаль. Источники образования. Пути метаболизма
3.3. Метаболизм О-лактата в клетках млекопитающих
ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ
Раздел II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Используемые препараты и реактивы
2. Получение супернатанта (10 ООО д) из печени крыс
3. Выделение микросомальной фракции из печени крыс
4. Встраивание токоферола в микросомальную мембрану
5. Выделение митохондриальной фракции из печени крыс
6. Определение белка в субклеточных фракциях
7. Определение дыхательного контроля в митохондриях печени крыс
8. Инициирование окислительных процессов в микросомах и супернатанте
(10 000 д)
9. Измерение интенсивности перекисного окисления липидов
10. Регистрация накопления метилглиоксаля в супернатанте (10 ООО д)
11. Определение редокс состояния цитохрома Ь5
12. Определение супероксида
13. Определение уровня О-лактата
14. Расчет концентрации регистрируемого продукта методом добавок
15. Определение активности глиоксалазы I
16. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
17. Определение активности фосфоглюкоизомеразы
18. Статистический анализ данных
Раздел III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 1. Влияние МАБН-зависимой электрон-транспортной цепи на образование МДА в микросомальных мембранах
1.1. Образование МДА при различных способах инициирования окислительных процессов; эффект токоферола
1.2. Образование МДА в микросомальных мембранах; эффекты ПАО(Р)Н-цитохром-Ь5-редуктазы
1.3. Влияние мерсалила на индукционный период при инициировании окислительных процессов
1.4. Исследование редокс состояние цитохрома Ь5 в микросомах и
оценка уровня супероксида при различных условиях инкубации
Глава 2. Возможность изомеризации альдегидов
2.1. Влияние глюкозо-6-фосфата и глутатиона на процесс накопления МДА
2.2. Исследование динамики накопления метилглиоксаля и Р-лактата при инициировании окислительных процессов
Глава 3. Метаболизм й-лактата в митохондриях печени крыс
Раздел IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Раздел V. ВЫВОДЫ
Раздел VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Список сокращений
АДФ - аденозиндифосфорная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АФК - активные формы кислорода
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
МДА - малоновый диальдегид
ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты
ПОЛ - перекисное окисление липидов
ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
СшпООН - гидроперекись кумола
FAD - фавинадениндинуклеотид
FMN - флавинаденинмононуклеотид
GSH - глутатион восстановленный
GSSG - глутатион окисленный
V - липидный (аллильный) радикал
LH - жирная кислота в составе фосфолипидов мембран
L02‘ - перекисный радикал
LOOH - перекись липида
NADH - никотинамидадениндинуклеотид
NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
SOD - супероксиддисмутаза
ТО* - радикал токоферола
ТОН - токоферол
TQ - токоферилхинон
КоА - кофермент А

Для приготовления среды инкубации всегда использовали свежие растворы сульфата железа (II). Концентрация белка в пробах была 1 мг/мл. Окислительный стресс индуцировали либо ферментативным путем (0,5 мМ NADPH), либо неферментативным путем (12 мкМ FeSC>4 / 0,5 мМ аскорбата или 0,26 мМ гидроперекись кумола). Через определенный интервал времени из инкубационной смеси отбирали аликвоты для определения МДА, NADH и а-токоферола.
Эксперименты с микросомальной фракцией проводились в присутствии NADH (0,5 мМ, 1,0 мМ), а также ингибитора флавопротеида -мерсалила (1,0 мМ).
Эксперименты с супернатантом (10 000 g) проводились в присуствии 1 мМ глюкозо-6-фосфата (субстрата фосфоглюкоизомеразы), 1 мМ глутатион (кофактора глиоксалазной системы), 10 мМ МДА, 10 мМ метилглиоксаля. Через определенный интервал времени из колб отбирали аликвоты для определения МДА, метилглиоксаля и D-лактата в супернатанте.
9. Измерение интенсивности перекисного окисления липидов
течение инкубации отбирали аликвоты в раствор, содержащий 0,6% раствор тиобарбитуровой кислоты в 1% трихлоруксусной кислоты. Затем пробы помешали в кипящую водяную баню на 20 минут для развития окраски. После этого для удаления осажденных белков пробы подвергали центрифугированию в течение 10 минут при 2000 g. Спектры поглощения триметинового комплекса, образующегося при реакции тиобарбитуровой кислоты с МДА, регистрировали на спектрофотометре Hitachi 557 в области 535 нм. Количество МДА определяли с учетом разбавления, использую молярный коэффициент (X = 535 нм, е = 1,56 • 105 М'1 см'1) [Владимиров, Арчаков, 1972] или с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ с флуоресцентрным детектированием (детектор “Shimadzu RF-535”, Япония) (?ieX = 530 нм, Я.ет = 550 нм) (Рис. 5). Хроматографическое разделение