Подавление экспрессии гена MDR1 с помощью малых интерферирующих РНК

• Автор: Логашенко, Евгения Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 126 с. : ил.

Список сокращений
г Введение
Глава 1. Механизм РНК-интерференции и перспективы применения интерферирующих РНК в биомедицине (обзор литературы)
1.1 Механизм РНК-интерференции
1.1.1 Фаза инициации
1.1.1.1 Белок Дайсер
1.1.1.2 Процессинг дцРНК
1.1.1.3 Влияние структуры дцРНК на эффективность ее расщепления белком Дайсер
1.1.2 Эффекторная фаза
* 1.1.2.1 Сборка комплекса ЯРС
1.1.2.2 Белок Адо2
1.1.2.3 Сборка комплекса Я1БС
1.1.2.4 Расщепление мРНК-мишени
1.1.3 Особенности протекания РНКи у различных организмов
1.2 Свойства и структура 81РНК
1.2.1 Нуклеотидный состав з(РНК..,
• 1.2.1.1 Влияние мисматчей на эффективность действия эРМК
1.2.2 Термодинамические параметры дуплекса
1.2.3 Влияние вторичной структуры мРНК-мишени на активность э1РНК
1.2.4 Влияние длины э1РНК на её активность
1.2.5 Химически модифицированные э1РНК
1.2.5.1 Влияние химических модификаций 3'- и 5'- концов гРНКна ее биологическую активность
1.2.5.2 Влияние химических модификаций нуклеотидов и фосфатных
групп в составе г/РНК на ее биологическую активность
Модификация фосфата
Модификации рибозы
Модификации азотистых оснований
1.2.6 Специфичность действия э!РНК
1.2.6.1 Индукция интерферонового ответа
1.2.6.2 Действие эРНК на экспрессию частично гомологичных генов
1.2.6.3 Конкуренция гРНКза компоненты комплекса Й1БС

1.3 Использование э'/РНК т чЫо.

1.3.1 Локальное применение
1.3.2 Системное применение
* 1.3.2.1 Гидродинамическая доставка
1.3.2.2 Рецептор- опосредованная доставка
1.4 Испытание з|РНК на мышиных моделях заболеваний человека
1.4.1 Воспалительные заболевания
1.4.2 Онкологические заболевания
1.5 Заключение
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1 Материалы
2.1.1 Реактивы, препараты и оборудование
2.1.2 Линии клеток
2.1.3 Олигонуклеотиды
2.1.4 Буферы и растворы, использованные в работе
2.2 Методы
2.2.1 Электрофорез
2.2.1.1 Электрофорез в агарозном геле
2.2.1.2 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
* 2.2.1.3 Электрофорез в ПААГ в нативных условиях
2.2.2 Введение [32Р]-метки в 5’-концевое положение олигорибонуклеотидов
2.2.3 Введение остатка флуоресцеина в З’-концевое положение антисмысловой цепи Э1РНК
2.2.4 Гибридизация олигорибонуклеотидов (образование э1РНК дуплекса)
2.2.5 Частичный гидролиз олигорибонуклеотида в денатурирующих условиях
2.2.5.1 Статистическое расщепление олигорибонуклеотида 2 М
щ имидазолом
2.2.5.2 Расщепление олигорибонуклеотида РНКазой Т1 в денатурирующих условиях
2.2.6 Исследование нуклеазоустойчивости з|РНК в среде IМЭМ, содержащей 5%-ную БВЭ
2.2.7 Исследование эффективности проникновения з1РНК Е в клетки линии КВ-8
I 2.2.7.1 Трансфекция клеток в/РНК
2.2.7.2 Оценка проникновения э'РНК в клетки

2.2.8 Выделение суммарной клеточной РНК
2.2.9 Измерение уровня экспрессии определенных генов в культивируемых клетках методом ОТ-ПЦР
2.2.9.1 Обратная транскрипция
2.2.9.2ПЦР
2.2.10 Определение чувствительности клеток к винбластину (МТТ тест)
2.2.11 Измерение функциональной активности Р-гликопротеина
2.2.12 Вестерн-блот анализ (определение количества белка Р-гликопротеина),
Глава 3. Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости с
помощью малых интерферирующих РНК (Результаты и обсуждение)
3.1 Выбор мишени
3.2 Характеристика использованных линий клеток
3.3 Исследование ингибирования экспрессии гена МйЙ1 под действием э!РНК
3.3.1 Анализ проникновения з!РНК в клетки КВ-8-5 в присутствии и отсутствие трансфецирующего реагента Олигофектамина
3.3.2 Влияние э1РНК на уровень мРНК гена МйИ1
3.3.3 Восстановление чувствительности клеток к цитостатикам под действием з!РНК
3.4 Анализ специфичности действия используемых э1РНК
3.5 Влияние выбора мишени в составе мРНК гена МйЯ1 на эффективность подавления экспрессии этого гена под действием э1РНК
3.5.1 Восстановление чувствительности клеток к винбластину под действием з1РНК, направленных к различным участкам мРНК гена МйИ1
3.5.2 Действие з!РНК на клетки КВ-3-1 и КВ-8-5 при культивировании
без винбластина
3.5,3. Влияние анти-МО/^РНК на уровень Р-гликопротеина
3.5.4 Влияние использования различных з1РНК на функциональную активность Р-гликопротеина
3.6. Химические модификации
3.6.1. Использованные химические модификации
3.6.2. Исследование сохранности эЕРНК в культуральной среде
3.6.3. Биологическая активность з1РНК и ее химически модифицированных аналогов
3.6.3.1 Влияние на биологическую активность яРИК содержания в ее составе полностью 2'-0- метилированных цепей

1.3.1 Локальное применение
Клетки млекопитающих, даже активно поглощающие вещества из окружающей среды (например, дендритные клетки или макрофаги), не могут эффективно усваивать такие небольшие молекулы, какими являются siPHK [128, 214]. Это препятствие для большинства клеток легко преодолевается in vitro с помощью трансфекционных реагентов на основе катионных липидов для доставки siPHK в клетки. Некоторые трансфекционные реагенты на основе липидов успешно используются и для локальной доставки siPHK in vivo [215], несмотря на то, что большинство из них обладают токсическим побочным действием, ограничивающим их применение in vivo. siPHK в комплексе с Олигофектамином захватывается эпителиальными клетками влагалища трансгенных мышей, экспрессирующих GFP, и эффективно подавляет в них экспрессию этого белка-маркера [215]. Такая же стратегия доставки использовалась для защиты мышей от интравагинальной инокуляции летальной дозы вируса простого герпеса (HSV-2), подавление вирусной экспрессии наблюдалось даже тогда, когда

aHTH-HSV-2 siPHK вводили через 3 ч после вирусного заражения. В тканях, трансфецированных комплексом siPHK-Олигофектамин, не наблюдалась индукция выработки ИФН и какие либо цитотоксические эффекты [215]. Показано, что интраназальное или внутритрахеальное введение siPHK эффективно подавляет экспрессию генов в легких. В большинстве таких исследований применялась доставка siPHK с помощью липидных трансфекционных реагентов, однако в некоторых исследованиях эффективная доставка и подавление экспрессии гена в легких были продемонстрированы и в отсутствии трансфектантов [26, 27, 211]. Не зависимо от

присутствия или отсутствия трансфекционного реагента Trans-IT ТКО, интраназальное применение siPHK эффективно защищает мышь от респираторно-синцитиального вируса и вируса парагриппа [211]. При внутритрахеальном введении раствора siPHK в глюкозе, siPHK эффективно проникала в клетки легких макак-резусов [216]. Профилактическое и терапевтическое применение siPHK против SARS (тяжелый острый респираторный синдром, атипичная пневмония) коронавируса приводило к подавлению вирусной репликации и предохраняло животных от развития синдромов I' SARS и легочной патологии. Это была первая демонстрация возможности
эффективного применения siPHK на приматах.
Глазные болезни оказались одной из первых мишеней для применения siPHK in vivo, благодаря относительной изоляции и легкости, с которой siPHK могут быть доставлены в ткани глаза. Препарат siPHK для лечения пациентов с.возрастной дистрофией сетчатки (AMD, age-related macular degeneration) находится на первой фазе клинических испытаний. Неоваскуляризация, рост новых кровеносных сосудов у, внутри глаза, приводит к потере зрения у взрослых. Центральная роль в стимуляции
роста новых кровеносных сосудов принадлежит VEGF (сосудистый эндотелиальный