+
Действующая цена700 499 руб.
Товаров:
На сумму:

Электронная библиотека диссертаций

Доставка любой диссертации в формате PDF и WORD за 499 руб. на e-mail - 20 мин. 800 000 наименований диссертаций и авторефератов. Все авторефераты диссертаций - БЕСПЛАТНО

Расширенный поиск

"Некультивируемые" формы бактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis и их биохимическая характеристика

  • Автор:

    Салина, Елена Геннадьевна

  • Шифр специальности:

    03.00.04

  • Научная степень:

    Кандидатская

  • Год защиты:

    2006

  • Место защиты:

    Москва

  • Количество страниц:

    140 с. : ил.

  • Стоимость:

    700 р.

    499 руб.

до окончания действия скидки
00
00
00
00
+
Наш сайт выгодно отличается тем что при покупке, кроме PDF версии Вы в подарок получаете работу преобразованную в WORD - документ и это предоставляет качественно другие возможности при работе с документом
Страницы оглавления работы

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
11 СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ» - СТРАТЕГИЯ ВЫЖИВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК В НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ (СТРЕССОВЫХ) УСЛОВИЯХ?
1 1 1 Явление "некультивируемости” в бактериальных популяциях
1 1 2 Критерии состояния “некультивируемости"
1 1 3 Образование “некультивируемых” форм бактерий в различных условиях
1 2 РЕАКТИВАЦИЯ («ОЖИВЛЕНИЕ») НК ФОРМ БАКТЕРИЙ
1 3 «СОЦИАЛЬНОЕ» ПОВЕДЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ И
СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ»
1 4 ЛАТЕНТНОСТЬ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
1 4 1 Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis
на экспериментальных животных
1 4 2 Модели получения покоящихся («некультивируемых») форм
Mycobacterium tuberculosis in vitro
1 5 БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТКАХ МИКОБАКТЕРИЙ
ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЛАТЕНТНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА
1 6 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ МИКОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЕРСИСТЕНЦИИ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
21 Выращивание бактериальных культур
2 2 Подсчет общего числа клеток
2 3 Микроскопические исследования
2 4 Оценка культивируемости клеток
2 5 Реактивация «некультивируемых» клеток
2 6 Приготовление клеточных экстрактов
2 7 Выделение мембран
2 8 Определение концентрации белка
2 9 Определение активностей внутриклеточных ферментов
2 10 Определение оксидазных и дегидрогеназных активностей
211 Определение плавучей плотности клеток
2 12 Выделение и очистка рнк
2 13 Обратная пцр
2 14 ТРАНСКРИПТОМНЫЙ АНАЛИЗ
2 15 Получение рекомбинантных белков Rpf
2 16 Определение мурамидазной активности белков Rpf и его модификаций
2 17 Электрофорез белков Rpf в пааг
218 Иммуноблоттинг белков Rpf
219Твердофазныйиммуноферментныйанализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3 1 ПОЛУЧЕНИЕ НК ФОРМ БАКТЕРИЙ Р MYCOBACTERIUM 59 3 2 ХАРАКТЕРИСТИКА НК ФОРМ М SMEGMATIS АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
И ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ПРИ ПЕРЕХОДЕ КЛЕТОК В СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ»
3 3 РОЛЬ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА RPF В ПРОЦЕССАХ ПЕРЕХОДА КЛЕТОК МИКОБАКТЕРИЙ В НК СОСТОЯНИЕ И ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕАКТИВАЦИИ
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
КОЕ - колониеобразующие единицы
ОЧК - общее число клеток
МКР - метод конечных разведений
НВЧ - наиболее вероятное число
OD6oo- оптическая плотность при длине волны 600 нм
НК - «некультивируемый»
БСА- бычий сывороточный альбумин HdB - синтетическая среда Hartman’s-de Bont Rpf-фактор, способствующий оживлению (от англ. Resuscitation promoting factor)
ИФА - иммуноферментный анализ.
ПААГ - полиакриламидный гель
ДДС-Na -додецилсульфат натрия
PBS -солевой фосфатный буфер
TBS - солевой трис-буфер
ТГЭС -трис-глицин-этанол-ДДС-Na буфер
СУС - смерть, ускоряемая субстратом
СТС - хлорид 5-циано-2,3-дитолилтетразолия

Известно, что при воздействии неблагоприятных условий окружающей среды бактериальные клетки способны переходить в покоящееся состояние, сопровождающееся значительным снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Традиционно покоящееся состояние бактерий связывают с образованием специализированных структур (спор, цист и т.д.) Однако в последние годы была экспериментально установлена возможность перехода в покоящееся состояние и для неспорулирующих бактерий, происходящего без образования специализированных структур.
Особенный интерес представляет образование покоящихся форм неспорулирующими клетками микобактерий, и в частности, возбудителем туберкулеза бактерией Mycobacterium tuberculosis, в связи с предположением о том, что латентная форма туберкулезной инфекции связана с переходом бактерий в организме хозяина в покоящееся состояние. По данным ВОЗ, каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - М. tuberculosis, но до сих пор единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется, не существует. Известно, что микобактерии туберкулеза, находясь в человеческом организме в латентном состоянии, в течение длительного времени сохраняют свою жизнеспособность, и как следствие, опасность развития заболевания, но детектировать их крайне сложно, поскольку они, очевидно, обладают свойством «некультивируемости», то есть неспособностью расти на стандартных лабораторных средах.
Предпринимались многочисленные попытки моделирования латентного состояния туберкулеза in vitro. Достаточно популярной моделью перехода клеток в покоящееся состояние считается так называемая модель Вейна, заключающаяся в длительной инкубации клеток М. tuberculosis в условиях постепенного снижающейся концентрации кислорода (Wayne, 1994), однако в случае такого экспериментального подхода у покоящихся клеток не наблюдается формирования «некультивируемого» (НК) фенотипа. Поэтому степень адекватности такой модели для имитации латентной туберкулезной инфекции остается под вопросом, поскольку латентное состояние клеток М. tuberculosis in vivo в первую очередь характеризуется потерей

никелевые сетки с формваровой подложкой. Ультратонкие срезы окрашивали цитратом свинца по методу Рейнольдса (Reynolds, 1963) и анализировали в электронном микроскопе JEM-100B.
2.4. Оценка культивируемости клеток.
Оценка культивируемости клеток проводилась по их способности образовывать колонии на твердых питательных средах. Из суспензии бактериальных клеток последовательно готовили серию десятикратных разведений в свежей среде роста и затем 100 мкл каждого разведения высевали на агаризованную (1,5% агара) питательную среду (среда Sauton с добавлением БСА, глюкозы и NaCI для М. tuberculosis; среда Nutrient Broth для М. smegmatis). Инокулированные чашки культивировали при 37°С. Число колониеобразующих единиц (КОЕ) подсчитывали через 5 суток (М. smegmatis), 3-4 недели (М. tuberculosis) после высева, определяя его как среднее из результатов подсчета, сделанного в 3-х повторностях, относительная погрешность при этом не превышала 30%. Предел обнаружения КОЕ составлял 5 клеток в мл среды.
2.5. Реактивация «некультивируемых» клеток.
Для оценки числа реактивировавшихся клеток использовали метод конечных разведений (МКР), заключающийся в приготовлении серии последовательных 10-кратных разведений в свежей питательной среде с разбавлением бактериальной суспензии до концентрации 10 клеток в мл.
Mycobacterium smegmatis. Процедуру реактивации проводили в 48-луночном пластиковый планшете (“Corning", США), каждая лунка которого содержала 0,45 мл среды Sauton с добавлением 0,05% дрожжевого экстракта. Лунки содержали также по 50 мкл соответствующих серийных разведений клеток. Каждое разведение было представлено в 3-х повторностях. Контрольные лунки содержали дополнительно продуцент белка Rpf — бактерию Micrococcus, luteus в концентрации 105—106 кл/мл. Планшеты инкубировали в течение 6 суток при 370 С с перемешиванием (120 об/мин).
Mycobacterium tuberculosis. Процедуру реактивации проводили в пробирках, содержащих 1,8 мл среды Sauton с добавлением БСА, глюкозы и NaCI. Каждая лунка также содержала по 0,2 мл соответствующих серийных

Рекомендуемые диссертации данного раздела

Время генерации: 0.121, запросов: 967