Химически активные ДНК как инструмент исследования взаимодействий белков эксцизионной репарации оснований

• Автор: Назаркина, Жанна Константиновна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 163 с. : ил.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФЛЭПЭНДОНУКЛЕАЗЫ-1 И ЕЕ РОЛЬ В РЕПЛИКАЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДНК
1.1.1. Субстратная специфичность FEN1
1.1.2. Структурные элементы фермента и их связь с функцией
1.1.3. Взаимодействие FEN1 с другими белками. Влияние этих взаимодействий
на активность фермента
1.1.4. Синтез и регуляция активности FEN1
1.1.5. Роль FEN1 в репликации
1.1.6. Участие FEN1 в поддержании стабильности генома
1.1.7. FEN1 как фермент репарации
1.1.7.1. Роль FEN1 в репарации двухцепочечных разрывов
1.1.7.2. Участие FEN1 в эксцизионной репарации оснований
1.2. РОЛЬ ХИСС1 В КООРДИНАЦИИ ПРОЦЕССОВ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ И РЕПАРАЦИИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ РАЗРЫВОВ ДНК
1.2.1. Основные характеристики и структура Х11СС1
1.2.2. Взаимодействие ХВСС1 с другими белками
1.2.3. Роль ХЛСС1 в репарации одноцепочечных разрывов ДНК
1.2.4. Роль ХВ.СС1 в эксцизионной репарации оснований
1.2.5. Роль Х11СС1 в развитии заболеваний
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Выделение и очистка рекомбинантной флэпэндонуклеазы
человека, экспрессированной в клетках Е.соИ
2.2.2. Выделение и очистка рекомбинантного Х11СС1 человека, экспрессированного в клетках Е.соИ
2.2.3. Введение [32Р]-метки в 5'-конец олигонуклеотида и формирование ДНК-дуплексов
2.2.4. Гелъ-электофорез нуклеиновых кислот и белков
2.2.5. Создание флэп-структур, содержащих фотоактивную группу, присоединенную к основанию АСМР, расположенному в точке ветвления
2.2.6. Расщепление флэп-структур флэпэндонуклеазой
2.2.7. Проверка влияния ИРА на активность РЕМ1
2.2.8. Проверка плавления ДНК-дуплексов репликативным белком А
2.2.9. Проверка связывания флэп-субстратов с белками
2.2.10. Фотоаффинная модификация белков
2.2.11. Определение позиции расщепления флэп-формирующего олигонуклеотида
2.2.12. Синтез ДНК, катализируемый Ро1 Р
2.2.13.3’-5'экзонуклеазная активность АРЕ1
2.2.14. Создание ДНК-структур, содержащих фотоактивную группу
на 3'-конце инициирующего праймера

2.2.15. Идентификация продуктов модификации белков экстракта клеток
HeLa структурой ДНК8
2.2.16. Гликозилазная активность 0GG1 и NTH1
2.2.17. Расщепление АР-эндонуклеазой-1 ДНК, содержащей АР-сайт
или его синтетический аналог (THF)
2.2.18. ДНК-дуплекс, содержащий АР-сайт
2.2.19. Пришивка XRCC1 и 0GG1 к ДНК-дуплексу, содержащему 8-оксогуанин
2.2.20. Восстановление оснований Шиффа боргидридом натрия
2.2.21 Определение доменов XRCC1, участвующих в формировании
основания Шиффа с АР-сайтом
2.2.22 Взаимодействие белков экстрактов СНО с ДНК-структурами, содержащими АР-сайты
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
РАЗДЕЛ ЗЛ. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЛЭПЭНДОНУКЛЕАЗЫ-1 С РЕПЛИКАТИВНЫМ БЕЛКОМ А С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОТОАКТИВНЫХ ИНТЕРМЕДИАТОВ РЕПАРАЦИИ ДНК
3.1.1. Взаимодействие RPA с FEN1. Его влияние на активность FEN1
3.1.2. Конструирование флэп-структур, содержащих фотоактивную группу
3.1.3. Влияние структуры флэп-субстрата на эффективность модификации FENluRPA
3.1.4. Фотоаффинная модификация FEN1 и белков комплекса ЭРО
РАЗДЕЛ 3.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ФЛЭП-СТРУКТУР ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ СИСТЕМЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ
3.2.1. Влияние структуры ДНК на эффективность расщепления флэпэндонуклеазой
3.2.2. Влияние структуры ДНК на синтез, осуществляемый Pol р,
и З'-экзонуклеазную активность АРЕ1
3.2.3. Использование химерных структур для фотоаффинной модификации рекомбинантных белков
3.2.4. Фотоаффинная модификация белков экстрактов клеток HeLa
и фибробластов человека
ЗАКЛЮЧЕНИЕ К РАЗДЕЛАМ 3.1. И 3
РАЗДЕЛ 3.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ XRCC1 С ДНК И БЕЛКАМИ
ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ
3.3.1 Исследование взаимодействий белков ЭРО с ДНК-структурами, имитирующими интермедиаты эксцизионнойрепарации оснований, методом фотоаффинной модификации
3.3.2. Исследование взаимодействий XRCC1 с ДНК и белками на начальных этапах ЭРО с использованием ДНК-структур, содержащих фотоактивную группу
в матричной цепи
3.3.3. Взаимодействие XRCC1 с ДНК, содержащими АР-сайты
3.3.4. Взаимодействие XRCC1 с АР-сайтами осуществляется через NTD и
BRCT1 домены
3.3.5. Исследование взаимодействия XRCC1 с ДНК-структурами, содержащими АР-сайты, на уровне клеточных экстрактов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ К РАЗДЕЛУ 3
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
(d)NTP - (дезокси)рибонуклеозид-5'-трифосфат 8-oxoG - 7,8-дигидро-8-оксогуанин
АА8 - родительская по отношению к ЕМ9 клеточная линия яичников китайского хомячка
АРЕ1 - апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза
АТР - аденозин-5'-трифосфат
BLM - белок, обусловливающий синдром Блума
BRCT1 - центральный домен XRCC1
BRCT2 - С-концевой домен XRCC1
BSA - бычий сывороточный альбумин
СНО - клетки яичников китайского хомячка
CPS6 - гомолог митохондриальной нуклеазы позвоночных EndoG в C. elegans CRN1 - гомолог FEN1 в С. elegans
Dna2 - репликативная эндонуклеаза, обладающая геликазной активностью dRP - дезоксирибозофосфатная группа DTT -дитиотреитол
EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЕМ9 - линия клеток яичников китайского хомячка, несущих мутацию в гене XRCC1 ЕМ9-Х - клетки ЕМ9, трансфицированные вектором, кодирующим XRCC1 человека EMS - этилметансульфонат
РАВО-йСТР-экзо-М-[(4-азидотетрафторбензилиденгидразинокарбонил)-
бутилкарбамоил]-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат
РАР-бСТР-экзо-Х-{2-[Ъ1-(4-азидо-2,5-дифтор-3-хлорпиридин-6-ил)-3аминопропионил]аминоэтил}-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат
FEN1 - флэпэндонуклеаза
GEN-активность - эндонуклеазная FEN1 активность в отношении брешей Hepes - М-[2-гидроксиэтил]пиперазин-Ы'-[2-этансульфоновая кислота] hXRCCl -XRCC1 человека
12 -фрагмент XRCC1, в котором отсутствует С-концевой домен BRCT2
IPTG - изопропил-р-О-тиогалактозид
Ku70/Ku80 - субъединицы Ки-антигена
Lig Ilia - ДНК-лигаза Ilia
MBP - мальтозосвязывающий белок
MMS - метилметансульфонат
NAD - никотинамидадениндинуклеотид
NP-40 - Нонидет Р
NTD - N-концевой домен XRCC1
NTH1 - человеческий гомолог эндонуклеазы III E
OGGI - 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза
ОН - гидроксильная группа

Основные стадии процесса экцизионной репарации оснований описаны ранее в главе
1.1.7.2. В данной главе будут рассмотрены этапы ЭРО, проходящие с участием XRCC1. Показано, что hXRCCl стимулирует гликозилазную активность hOGGl, не оказывая влияния на лиазную функцию фермента [142]. Недавно обнаружено, что hXRCCl взаимодействует и с другими ДНК-гликозилазами: hNTHl, hNEILl/2 и MPG [151]. hXRCCl оказывает стимулирующее действие на АР-эндонуклеазную и 3'-фосфодиэстеразную активности АРЕ1. Суммарная АР-эндонуклеазная активность в экстракте клеток ЕМ9 выше, если экстракт содержит экзогенный hXRCCl или в клетки был введен вектор, кодирующий hXRCCl [152]. После обработки клеток ЕМ9, пероксидом водорода, вызывающим окислительные повреждения ДНК, изменяется внутриклеточная локализация hXRCCl [163]. Уровень совместной локализации hXRCCl с каждой из гликозилаз (hOGGl, hNTHl, hNEILl/2) после обработки клеток HeLa Н2О2 составил около 10% [151]. В ответ на обработку MMS 50% hXRCCl было локализовано с MPG-гликозилазой. Приведенные данные указывают на участие hXRCCl па начальных стадиях репарации поврежденных оснований.
Предполагается, что PARP1 также участвует в экцизионной репарации оснований [106, 113, 178]. При обработке клеток алкилирующими агентами происходит синтез поли(АБР-рибозы) [178]. При наличии одноцепочечных разрывов в ДНК происходит активация автополи(АВР-рибозил)ирования PARP1 [179]. В клетках, дефектных по PARP1, наблюдается уменьшение темпов репарации повреждений ДНК, вызванных алкилирующими агентами. Концентрация PARP1 в клетках в 3 раза превышает концентрацию XRCC1 [120]. Возможно, при несогласованности активностей ферментов ЭРО PARP1 распознает и связывает ДНК-фрагменты, содержащие разрывы, и привлекает XRCC1 к структурам, сформированным под действием АРЕ1 или бифункциональных ДНК-гликозилаз [113].
Кубота с соавторами исследовали влияние XRCC1 на процесс экцизионной репарации оснований в реконструированной системе, содержащей урацил-ДНК-гликозилазу, АРЕ1, Pol р и Lig Ilia [111]. Присутствие XRCC1 не является необходимым для репарации АР-сайтов. По данным авторов XRCC1 подавлял синтез с вытеснением цепи, осуществляемый Pol р. Было показано формирование тройного комплекса, содержащего XRCC1, Pol Р и расщепленный АР-дуплекс. Петерман с коллегами исследовали влияние АТР на репарацию АР-сайтов [115]. В отсутствие АТР и Lig Ilia эффективность включения одного нуклеотида в цепь ДНК за счет активности Pol Р увеличивается при добавлении XRCC1. XRCC1 стимулирует, а Lig Ilia ингибирует активность ДНК-