Глутаматдегидрогеназы и регуляция ферментов ассимиляции аммония у одноклеточных зеленых водорослей

• Автор: Софьин, Алексей Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 173 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

РЕГУЛЯЦИЯ И СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ АССИМИЛЯЦИИ АММОНИЯ У ОДНОКЛЕТОЧНЫХ ЗЕЛЕНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ ГЛАВА I. Общая характеристика ферментов ассимиляции аммония

1.1 Пути ассимиляции аммония.

1.2 Общая характеристика ГС, ГОГАТ и ГДГ.

1.2.1 Глутаминсинтетаза .

1.2.2 Глутаматсинтаза .

1.2.3 Глутаматдегидрогеназа

ГЛАВА 2. Зависимость активности ГС, ГДГ и ГОГАТ хлореллы от условий азотного питания

2.1 Регуляция путей ассимиляции аммония у прокариотов

2.2 Зависимость активности ГС и ГОГАТ хлореллы от условий азотного питания
2.3 Индукция НАДФГДГ у хлореллы при ассимиляции экзогенного аммония .
ГЛАВА 3. Свойства ГДГ одноклеточных зеленых водорослей
3.1 Физикохимические свойства ГДГ одноклеточных зеленых водорослей
3.2 Кинетические свойства ГДГ одноклеточных зеленых водорослей.
ЧАСТЬ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ГЛАВА I. Объект исследования
. Использованные виды и штаммы одноклеточных зеленых водорослей и условия их культивирования. . .
стр.
. 1.2 Получение бесклеточных экстрактов .
ГЛАВА 2. Методы определения активности ферментов ассимиляции аммония и определения концентрации белка
2.1. Определение активности ГДГ
2.2 Определение активности ГС
2.3 Определение активности ГОГАТ .
2.4 Определение концентрации белка
ГЛАВА 3. Методы разделения, очистки и изучения физикохимических свойств ГДГ ИЗ А.Ъгашги
3.1. Разделение двух ГДГ
3.2. Использованные приемы очистки ГДГ
3.2.1 Прогревание препаратов НАДФГДГ
3.2.2 Ультрафильтрация
3.2.3 Фракционирование сульфатом аммония
3.2.4 Сорбция на геле фосфата кальция.
3.2.5 Хроматография на АНсефарозе 4В.
3.2.6 Ионообменная хроматография
3.2.7 Гельфильтрация
3.2.8 Аффинная хроматография
3.3 Дискэлектрофорез в полиакриламидном геле и
проявление зимограмм тетразолиевым методом
3.4 Определение молекулярных масс ГДГ
3.4.1 Определение молекулярных масс нативных ГДГ
из А.ЬгаипИ методом гельфильтрации . .
3.4.2 Определение молекулярной массы субъединиц
НАД ФГДГ.
3.5 Определение содержания спиральной структуры
стр.
ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА I. Зависимость активности ферментов ассимиляции аммония одноклеточных зеленых водорослей от условий азотного питания
1.1 Зависимость активности ГДГ одноклеточных зеленых водорослей от условий азотного питания. Изоферментный состав ГДГ одноклеточных зеленых водорослей.
1.2 Зависимость активности ГС одноклеточных зеленых
в од ор осла от условий азотного питания.
1.3. Локализация места синтеза индуцируемой аммонием НАДФГДГ хлореллы, конститутивной НАДФГДГ и ГС
.ii.
1.4 Зависимость активности ГОГАТ одноклеточных зеленых водорослей от условий азотного питания .
Заключение.
ГЛАВА 2. Свойства ГДГ из клеток .ii
2.1 Разделение и очистка ГДГ .ii
2.1.1 Разделение ГДГ.
2.1.2 Очистка НАДФГДГ.
2.1.3 Очистка НАДФГДГ.
2.2 Физикохимические свойства ГДГ .ii
2.2.1 Молекулярная масса
2.2.2 Тепловая инактивация
2.2.3 Влияние диссоциирующих агентов .
2.2.4 Дейотвие параоксимеркурибензоата пОМБ . .
2.3 Кинетическое поведение ГДГ .ii
2.3.1 Зависимость активности ГДГ от концентрации
восстановленных кофакторов .
стр.
2.3.2 Зависимость активности ГДГ от концентрации 2оксоглутарата
2.3.3 Зависимость активности ГДГ от концентрации
ионов аммония .
2.3.4 Кинетическое поведение ГДГ в реакции окислительного дезаминирования
2.3.5 Влияние продуктов реакции на активность ГДГ
А.ЪгаипИ . Физиологическая роль ГДГ . . .
Заключение.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Таким образом, полученные в настоящей работе данные, вносят существенный вклад в развитие фундаментальных представлений о путях ассимиляции аммония и их регуляции у растительных организмов, а также в характеристику отдельных ферментов ассимиляции аммония у одноклеточных зеленых водорослей. Кроме того, практическое значение имеет предложенный способ разделения ГДГ, который уже используется для разделения ГДГ других одноклеточных зеленых водорослей, а также может использоваться в лабораторной практике и, возможно, в промышленных условиях для разделения и очистки различных ферментов. ГЛАВА I. I.I. Хотя аммоний в клетках различных организмов может включаться в органические соединения при участии нескольких ферментов, таких как ГДГ, ГС, карбамоилфосфатсинтаза, аланиндегидрогеназа, аспартаза, аспарагинсинтетаза и некоторых других, все же еще не так давно считалось, что восстановительное аминирование 2оксоглутаровой кислоты, катализируемое ГДГ, является тем главным и наиболее широкораспространенным путем, по которому неорганический азот в форме аммония включается в Ааминный азот глутаминовой кислоты и, тем самым, вступает в азотный обмен клетки Кретович, . Такое мнение существовало несмотря на то, что было известно о гораздо более высоком сродстве ГС к ионам аммония, о, , , а также несмотря на то, что в экспериментах с меченым ыаммонием обнаруживали его включение в первую очередь в амидную группу глутамина и лишь затем в аминнуго группу глутаминовой кислоты Кретович и др. I6I0 , , . Однако поскольку не было известно эффективного пути превращения амидного азота глутамина в Ааминный азот, ГС, катализирующая образование глутамина из глутамата и аммония, рассматривалась как фермент, участвующий в детоксификации и резервировании поступающего в клетку аммония Кретович, . Оценка роли ГДГ и ГС в первичной ассимиляции аммония была
кардинальным образом пересмотрена с открытием в г. I и обнаружением широкого распространения ГОГАТ, осуществляющей восстановительный перенос амидной группы глутамина на 2оксоглутарат с образованием двух молекул глутаминовой кислоты. Стало очевидным существование еще одного пути ассимиляции аммония, функционирование которого обеспечивается совместным действием ГС и ГОГАТ. Высокое сродство ГС по отношению к аммонию послужило основанием для вывода о том, что в естественных условиях его ассимиляция происходит преимущественно с помощью ГС и ГОГАТ, тогда как ГДГ участвует в этом процессе лишь в тех исключительных случаях, когда внутриклеточная концентрация аммония резко увеличена ii , , . Таким образом, в настоящее время у различных организмов показано наличие двух главных путей первичной ассимиляции аммония. Ферменты, действие которых обеспечивает функционирование этих путей у микроорганизмов и растений ГС, ГОГАТ и ГДГ, кратко охарактеризованы в следующих разделах данной главы. За последние годы был опубликован ряд обзоров и монографий, в которых детально проанализированы и обобщены результаты изучения распространения ГС, ГОГАТ и ГДГ среди различных организмов, локализации их в различных органах и тканях и внутриклеточной локализации, данные по изучению множественных молекулярных форм, физикохимических свойств, кинетического поведения и структурной организации Кретович, Вготш . Шатилов, I3 v . Молек. Ввиду этого вышеуказанные вопросы здесь в основном обсуждаться не будут, за исключением некоторых данных, касающихся ГС, ГОГАТ и ГДГ одноклеточных зеленых водорослей. Будет дана лишь характеристика этих ферментов и кратко рассмотрена регуляция их синтеза и активности в клетках микроорганизмов и растений. I.2. ГС ьглутамат аммиаклигаза АДФ, КФ 6. Впервые ГС была обнаружена в тканях животных i , и вскоре, поскольку уже была известна важная роль глутамина в обмене растений, она была выделена из растительного материала , , . Однако эти реакции не имеют, очевидно, никакого биологического значения Молек. В настоящее время ГС обнаружена во всех живых организмах бактериях, грибах, одноклеточных зеленых водорослях, различных органах и тканях высших растений и животных.