Гибридная Mn-пероксидаза гриба Panus Tigrinus 8/18

• Автор: Лисов, Александр Викторович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 95 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Строение лигнина.

ГЛАВА 2. Грибы деструкторы лигнина.

ГЛАВА 3. Этимология разложения лигнина.

3.1 Лигнин пероксидаза.

3.1.1 Окисление различных субстратов лигнин пероксидазой.

3.1.2 Участие вератрилового спирта в окислении субстратов

3.1.3 Лигнинолитические свойства лигнин пероксидазы

3.2 Мппероксидаза.

3.2.1 Механизмы реакций, катализируемых Мппероксидазой

3.2.2 Реакции Мппероксидазы с участием радикалов
3.2.3 Разложение лигнина Мппероксидазой.
3.3 Гибридная Мппероксидаза.
3.4 Строение активных центров лигнинолитических пероксидаз.
3.5 Условия продукции лигнинолитических пероксидаз.
3.6 Разложение ксенобиотиков лигнинолитическими пероксидазами
3.7 Лакказа
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. Материалы и методы
4.1 Реактивы и материалы.
4.2 Объект исследования и его культивирование
4.3 Очистка фермента.
4.4 Электрофорез.
4.5 Спектральные методы и получение интермедиатов каталитического цикла
4.6 Пиридингемохромовый метод и определение коэффициентов молярной экстинкции фермента.
4.7 Проведение реакции с бензиновыми спиртами и модельным соединением лигнина в присутствии медиаторов
4.8 Идентификация продуктов реакции медиаторов с бензиновыми спиртами и модельным соединением лигнина.
4.9 Методы определения активности ферментов
4. Аналитические методы
4. Определение концентрации белка
4. Инактивация фермента в присутствии ГБТ и ГБТО.
4. Определение типа ингибирования фермента
4. Реакция гибридной Мппероксидазы с 2,4,6ТХФ в присутствии ГБТ
ГЛАВА 5. Результаты исследований
5.1 Очистка гибридной Мппероксидазы
5.2 Спектральные свойства гибридной Мппероксидазы
5.3 Субстратная специфичность.
5.4 Каталитический цикл гибридной Мппероксидазы
5.5 Оксидазная реакция гибридной Мппероксидазы.
5.5.1 Окисление НАДН гибридной Мппероксидазой
5.5.2 Участие различных форм фермента в окислении НАДН
5.6 Окисление субстратов в присутствии медиаторов.
5.7 Инактивация гибридной Мппероксидазы в присутствии медиаторов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Активность пероксидазы полностью зависит от наличия Мп2, который окисляется ферментом до Мп3. Однако, Мппероксидаза не способна окислять наиболее устойчивые нефенольные подструктуры лигнина iii . . Поэтому, долгое время ведущая роль в разложении полимерного лигнина отводилась лигнин пероксидазе, ферменту, обладающему мощным окислительным потенциалом и способному разрушать нефенольные связи. пероксидазы v . i, , . Способность пероксидазы окислять нефенольные соединения можно объяснить участием медиаторов низкомолекулярных соединений, окисляемых до промежуточных радикалов, которые далее реагируют с конечным субстратом. Участие медиаторов в окислении нефенольных соединений хорошо известно у лакказы, для которой подобные реакции используются в биотехнологии , , . В качестве медиаторов пероксидаза способна использовать ненасыщенные жирные кислоты, а также соединения, содержащие группы . iii . . Существование эффекта медиаторов позволяет поставить Мппероксидазу на один уровень с лигнин пероксидазой. Несмотря на важное прикладное значение реакций с участием медиаторов, более подробных исследований разнообразия веществ, позволяющих пероксидазе окислять нефенольные соединения, не проводилось. Наряду с лигнин пероксидазой и Мппероксидазой у нескольких грибов был обнаружен третий лигнинолитический фермент гибридная Мппероксидаза, сочетающий в себе свойства ранее открытых лигнинолитических пероксидаз iv . , i, . Этот фермент подобно пероксидазе способен окислять Мп2 до Мп3 и, подобно лигнин иероксидазе, окисляет органические соединения, в том числе и нефенольные . Гриб ii 8 является эффективным деструктором лигнина, наличие лигнин пероксидазы в составе его лигнинолитического ферментного комплекса обнаружено не было, тем не менее гриб обладает высокой активностью пероксидазы и лакказы v . пероксидаза гриба . пероксидаза, были охарактеризованы молекулярные свойства фермента и Мп2зависимые реакции, показана способность окислять НАДН в оксидазной реакции без перекиси водорода Леонтьевский и др. Однако, необычные свойства гибридной Мппероксидазы гриба ii 8, механизм окисления НАДН, а также участие различных форм фермента в этом процессе детально не были изучены. Цель и задачи исследования. Цель работы изучить гибридные свойства Мппероксидазы гриба . псроксидазы с синтетическими медиаторами в присутствии ароматических спиртов. Научная новизна работы. Впервые изучено Мп2независимое окисление субстратов гибридной Мппсроксидазой гриба . Экспериментально показано, что каталитический цикл фермента может функционировать как в присутствии Мп2, так и без него за счт органического вещества. Показано, что оксидазная реакция окисления НАДН происходит только в присутствии Мп2 Полученные данные свидетельствуют о том, что фактически реакция является обычной пероксидазной. Роль Мп2 заключается в защите фермента от инактивации и продолжении образования перекиси водорода за счт Мп. Впервые показано, что гибридная пероксидаза способна окислять нефенольные соединения в присутствии некоторых медиаторов, и реакция осуществляется за счт окисления медиатора с помощью Мп3. В результате взаимодействия фермента с медиаторами наблюдалась его инактивация. Практическая значимость. Гибридная пероксидаза обладает высокой окислительной способностью и неспецифичностью действия, что позволяет ей трансформировать широкий спектр субстратов. Изученные реакции с участием медиаторов усиливают окислительную способность фермента и могут быть использованы при делигнификации растительного материала или разложении ксенобиотиков. Полученная информация о механизме катализа различных реакций, в том числе Мп2независимого и Мп2зависимого окисления субстратов, а так же реакциях с участием НАДН, расширяют наши представления о функционировании гибридной пероксидазы в составе лигнинолитических ферментативных комплексов грибов.