Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и антиангиогенных агентов

• Автор: Фельдман, Наталия Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 248 с. : ил.

Список сокращений
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Химиотерапия онкологических заболеваний и препятствия на
пути ее эффективного применения
1.1.1. Концепции лекарственной устойчивости опухолей
1.1.2. Устойчивость опухолей различных классов к химиотерапии
1.1.3. Основные классы противоопухолевых веществ, их структура и механизмы цитотоксического действия
1.1.4. Показания к применению и методы введения химиопрепаратов
1.1.5. Факторы, препятствующие эффективному проведению химиотерапии
1.1.6. Влияние множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток на эффективность действия химиопрепаратов
1.1.7. Гены и белки, участвующие в проявлении феномена МЛУ
1.1.8. Диагностика МЛУ
1.1.9. Накопление и внутриклеточное распределение химиотерапевтических препаратов в резистентных клетках
1.1.10. Значение МЛУ для лечения онкологических заболеваний
1.2. Стратегии создания систем для направленной доставки химиопрепаратов к опухолевым клеткам
1.2.1. Преимущества и недостатки использования СНД
1.2.2. Ковалентное связывание
1.2.3. Нековалентное связывание
1.2.4. Критические параметры для использования СНД
1.2.5. Внутриклеточный транспорт химиопрепарата, ковалентно связанного с вектором
1.3. Опухолевый ангиогенез как мишень для терапии
1.3.1. Роль ангиогенеза в процессах опухолевого роста

1.3.2. Механизм каскадной передачи регуляторных сигналов в эндотелиальных клетках
1.3.2.1. Роль рецепторов клеточной поверхности эндотелиоцитов в передаче митогенных сигналов
1.3.2.2. Механизмы передачи сигналов выживания эндотелиальных клеток
1.3.2.3. Механизм проведения регуляторных сигналов, вызывающих миграцию эндотелиальных клеток
1.3.2.4. Передача сигналов деградации внеклеточного матрикса
1.3.2.5. Передача сигналов регуляции дифференцировки и морфогенеза
1.3.3. Достижения и перспективы антиангиогенной терапии
1.3.3.1. Ингибиторы матриксных металлопротеиназ
1.3.3.2. Препараты, подавляющие пролиферацию эндотелиальных клеток
1.3.3.3. Антисмысловые последовательности, кодирующие УБвР
1.3.3.4. Ингибиторы рецепторных тирозинкиназ
1.3.3.5. Препараты, влияющие на выживание эндотелиальных
клеток
1.3.3.6. Препараты, блокирующие интегрины
1.3.3.7. Ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста
(ЕОРЛ)
1.3.3.8. Ингибиторы Са2+-каналов
1.3.3.9. Ингибиторы циклооксигеназы-2 (СОХ-2)
1.3.3.10. Талидомид
1.3.3.11. Интерферон-а
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2Л. Выделение и очистка ЭФР
2.2. Выделение и очистка АФГ1
2.2.1. Иммобилизация моноклональных антител на сефарозе
2.2.2. Фракционирование полиэтиленгликолем
2.2.3. Аффинная хроматография
2.2.4. Ионообменная хроматография

2.2.5. Г ель-проникающая хроматография
2.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.3. Получение рекомбинантного 3-го домена а-фетопротеина
человека
2.4. Синтез пептидов - модифицированных фрагментов ЭФР и ТФРа
2.5. Получение коньюгатов
2.5.1. Конъюгаты ФЦ(А1), ФЦ(Со) и ВК с АФП и ЭФР
2.5.2. Коньюгаты ДР, КМ и ВБ с АФП и ЭФР
2.5.3. Коньюгаты ДР с векторными пептидами
2.6. Получение нативного ангиостатина
2.7. Получение рекомбинантного эндостатина человека
2.7.1. Конструирование экспрессионного вектора, кодирующего биосинтез рекомбинантного эндостатина человека
2.7.2. Выбор штамма-продуцента E. coli
2.7.3. Получение эндостатина путем экспрессии его гена в штамме
E.coli
2.7.4. Выделение эндостатина человека из клеток штамма-продуцента
E. coli
2.7.5. Очистка эндостатина человека, не содержащего б-His
2.7.6. Очистка эндостатина человека, включающего дополнительную последовательность б-His и сайт расщепления энтерокиназой
2.8. Получение липосомных форм ангиостатина и эндостатина
2.9. Культивирование клеток
2.10. Исследование интернализации пептидов
2.11. Изучение динамики интернализации ФИТЦ-меченых пептидов в опухолевые клетки
2.12. Определение цитотоксической активности препаратов in vitro
2.12.1. ЦТА фталоцианинов и их коньюгатов с векторными белками
2.12.2. ЦТА ангиостатина, эндостатина, антрациклиновых антибиотиков и растительных алкалоидов и их коньюгатов с векторными пептидами в отношении клеток линий QOS, SKOV3,
DU145, А431, MCF-7, В16, НТ1080, АВАЕ, SVEC4-10 и фибробластов человека

При получении химерных токсинов с использованием генноинженерных технологий токсин и вектор экспрессируются в клетках штамма-продуцента в виде химерного белка, компоненты которого связаны ковалентно. В случае ковалентного химического связывания противоопухолевого препарата с вектором также получается стабильная СНД, и поэтому доставка препарата к клеткам-мишеням может осуществляться более эффективно, чем при использовании нековалентных систем. С другой стороны, биологическая активность химиопрепарата может снижаться или теряться в результате ковалентного связывания с вектором. Обычно стараются сконструировать коньюгат таким образом, чтобы после интернализации он диссоциировал в клетке с образованием свободного препарата и векторной молекулы. Примером таких СНД могут служить коньюгаты вектор-препарат, связанные через пептидный спейсер, являющийся субстратом лизосомных ферментов [Trouet 1982, Seymour 1991]. В данном случае механизм действия коньюгата следующий: на первом этапе коньюгат связывается со специфическим рецептором через связывающий домен векторной молекулы. Затем, в результате эндоцитоза, химиопрепарат через последовательные стадии попадает в лизосомы, где происходит его отделение от вектора в результате протеолитического расщепления пептидного спейсера. При наличии достаточной липофильности химиопрепарата, он может пересечь лизосомную мембрану и оказаться в цитозоле [Seymour 1991].
1.2.3. Нековалентное связывание
Преимуществом нековалентного связывания является сохранение биологической активности химиопрепарата при формировании его комплекса с вектором. Кроме того, в случае использования ионных взаимодействий для связи препарата с вектором, комплекс может диссоциировать в кислой среде внутриклеточных компартментов таких как эндосомы и/или лизосомы. Для транспорта генов в клетку с помощью рецепторопосредованного эндоцитоза в качестве спейсера, связывающего плазмиду и вектор, широко используют полилизин [Wilson 1992, Perales 1994а, Wu 1998b; Wu 1988, Strom 1991] (рис. 6 Б). В этом случае связь между полилизином и вектором ковалентная, а