Молекулярные механизмы шапероноподобного действия амфифильных белков и пептидов

• Автор: Лютова, Елена Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Актуальность проблемы
Цель данной работы
Научная новизна и практическое значение работы
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Молекулярные шапероны
Участие молекулярных шаперонов в фолдинге
Классификация молекулярных шаперонов
Малые белки теплового шока
Роль белков теплового шока в функционировании
живых систем в норме и патологии
Шапероноподобные белки
Протендисульфидизомераза (PDI)
DsbC
Пептидил-пролил-цис-транс-изомеразы (PPI)
Семейство FKBP
PPI в роли шаперонов
Фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF)
Казеин
Тубулин
Кальнексии и кальретикулин
Антитела как специфические шапероны
а-Синуклеин
Спектрин
Пептиды, обладающие шапероноподобной
активностью
Влияние аргинина на агрегацию белков
Рефолдинг рекомбинантных белков in vivo и in vitro
Влияние полиаминов на агрегацию белков
Искусственные шапероны
Ускорение агрегации белков
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы
Материалы
Получение экстракта мозга быка
Обращенно-фазовая ВЭЖХ
N-концевое микросеквенирование
Масс-спектральный анализ
Электрофорез

Концентрацию белка
Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС)
Анализ шапероноподобной активности
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выделение и идентификация ЕКВР12
Исследование шапероноподобной активности ЕКВР12
Исследование влияния аргинина на агрегацию
модельных белковых субстратов
Кинетика агрегации АДГ
Кинетика агрегации инсулина
Исследование влияния трипептида (А^-РЬе-Ьув)
и дипептида (А^-РИе) на термоагрегацию АДГ
Исследование влияния синтетических аналогов пептидного антибиотика грамицидина
на агрегацию модельных белковых субстратов
Влияние М1Г на кинетику агрегации АДГ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список основных работ,
опубликованных по теме диссертации
БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АДГ алкогольдегидрогеназа
БСА бычий сывороточный альбумин
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ДЛС динамическое лазерное светорассеяние
ДС-Na додецилсульфата натрия
ДТТ дитиотреитол
ИС иммуносупрессор
ИФ иммунофилин
КН кальцинейрин
МДГ малатдегидрогеназа
ПААГ полиакриламидный гель
ТФК трифторуксусная кислота
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
ЭР эндоплазматический ретикулум
AcN ацетонитрил
ArgEE этиловый эфир аргинина
АТР аденозинтрифосфат
Bip Hsp78 в эндоплазматическом ретикулуме
СуР циклофилин
FKBP FK-binding pro ten, РК506-связывающий белок
GroEL Hsp60
GroES Hsp 10, кошаперонин Hsp60
GuFICl гуанидингидрохлорид
HEPES М-[2-гидрокси-этил]пиперазин-М’-
[2-этансульфонильная кислота]
Hsp heat shock proteins, белки теплового шока
sHsp small heat shock proteins, малые белки теплового шока

течение 20 минут, образовавшийся преципитат отделяли центрифугированием при 60000 g, 1 ч. Супернатант подвергали ультрафильтрации через мембрану РМ 30, а затем концентрировали, используя ПЭГ 20000 или мембрану UM 05. Полученный раствор диализовали против 20 мМ Tris-HCl буфера, pH 7,8, содержащего 5 мМ ß-ME и 1 мМ PMSF.
Диализат пропускали через ионообменную колонку 1,6 х 40 см с DEAE-Servacel, уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили в изократическом режиме со скоростью 1 мл/мин.
Обращенно-фазовая ВЭЖХ. Для идентификации белков, элюированных с ионообменной колонки, соответствующие аликвоты белкового пика фильтровали через фильтр фирмы Sartorius (0,45 мк) и фильтрат подвергали обратно-фазовой ВЭЖХ с использованием установки Gilson HPLC system (Франция) на колонках С8, Aquapore RP 300 (4.6 х 220 мм), Brownlee Labs (США) и С18 (4.6 х 220 мм), Vydac (США), снабженных предколонками (3.2 х 15 мм). Элюцию осуществляли с помощью линейного градиента: 0,1% ТФУ - 0,08% ТФУ в AcN (0 - 70%, 70 мин.) со скоростью 0,5 мл/мин. Пики белка, детектированные по абсорбции при 214 нм, собирали и высушивали в вакуумном концентраторе Speedvac drier, фирмы Savant (США).
N-концевое микросеквенирование. Автоматическое
микросеквенирование по Эдману проводили на секвенаторе модели 473 А, Applied Biosystems, Weiterstadt (Германия), снабженном системой анализа «on-line» производных фенилтиогидантоина. На фильтр картриджа наносили 50-150 пмоль белка в соответствии со стандартной методикой.
Масс-спектральный анализ. Белки фракций, полученных с помощью ВЭЖХ (10-50 пмолей), растворяли в 0,1% ТФУ и подвергали масс-спектральному анализу на установке MALDI-MS (Kratos, MALDI II equipment, Shimadzu, Europe).