Использование термостабильных ДНК-полимераз для анализа возбудителей вирусных и бактериальных инфекций методом полимеразной цепной реакции

• Автор: Глухов, Александр Иванович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 58 с. : ил.; 20х15 см

Актуальность проблемы
Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) произвело революционный переворот в молекулярной биологии и диагностике (Mullis К. et al. 1986). За открытие данного метода американский ученый Карл Мюллис был удостоен в 1993 году Нобелевской премии по химии.
Одной из важнейших проблем молекулярной биологии является проблема детекции малых количеств ДНК и РНК. Стандартные методы анализа нуклеиновых кислот либо очень трудоемки, либо требуют большого количества исследуемой ДНК или РНК. Открытие метода ПЦР дало в руки исследователей самый чувствительный метод анализа нуклеиновых кислот. С помощью данного метода даже из нескольких молекул ДНК можно получить необходимое количество копий ее специфического фрагмента. Использование термостабильных ДНК-полимераз привело возможности автоматизировать метод ПЦР (Sairi R.K. 1986, Krawets S.A. et al. 1989). Кроме того, было показано, что некоторые термостабильные ДНК-полимеразы обладают обратнотранскриптазной (ОТ) активностью (Tse W. Т., Forget B.G. 1990). Это свойство позволяет использовать данные ферменты для непосредственной детекции молекул РНК методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР (ОТ/ПЦР) (Myers W. Th., Gelfand D.H. 1991), что решает ряд проблем, связанных с негативным влиянием вторичной структуры РНК на эффективность синтеза кДНК. Одной из первых была изучена Taq-полимераза, ленная из термофильной бактерии Thermus aquaticus YT1 (Каледин A.C. и . 44)80, Saiki R.K. et al. 1988). В настоящее время осуществлен и ведется /к новых источников термостабильных ДНК-полимераз, обладающих iiliffM преимуществ по сравнению с Taq-полимеразой, например, более ’сокой термостабильностью, способностью амплифицировать участки ДНК чфъшей протяженности, низкой частотой ошибок при синтезе, ярко

.'Ьраженной ОТ-активностью (Francine В.Р. 1996).

В настоящее время амплификационная ДНК/РНК-диагностика, основанная на методах ПЦР и ОТ/ПЦР, все шире и шире используется в лабораторной и медицинской практике. Основными преимуществами этого метода, делающими его незаменимым в диагностике, являются, как уже отмечалось выше, высокая чувствительность, а также быстрота анализа (5-10 ч), позволяющая создавать тест-системы со специфичностью, приближающейся к 100%.
В последнее время к проблемам распространения СПИД, инфекционных гепатитов, герпетических инфекций, особоопасных инфекций (холера, чума), туберкулеза, стафилококковых инфекций и хламидиоза приковано самое пристальное внимание ученых и медиков. Однако нужно отметить, что быстрое выявление возбудителей данных заболеваний на сегодняшний день остается пока единственным реальным средством их профилактики. Таким образом, разработка высокочувствительных тест-систем на основе ПЦР является одной из важных задач современной науки и медицины.
Использование термостабильных ДНК-полимераз, способных катализировать ОТ/ПЦР и позволяющих тем самым детектировать молекулы мРНК различных белковых факторов, является ключевым моментом в РНК-диагностике. В частности, анализ в клиническом материале мРНК CD-4 рецептора, через который происходит инфицирование клеток вирусом иммунодефицита человека, вызывающего СПИД, а также мРНК гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1) может иметь важное значение с научной и медицинской точки зрения.
Цель и задачи исследования Цель настоящей работы состояла в отработке метода выделения и очистки термостабильной Tth ДНК-полимеразы из штамма термофильной бактерии Thermus thermophilus КТП и в использовании полученного гомогенного препарата фермента для подбора оптимальных условий анализа ДНК методом ПЦР и РНК методом ОТ/ПЦР. Кроме того, целью настоящей работы было

1 2 3 4 5 6 М

Рис. 18. Детекция ДНК CMV методом гПЦР с “внешними” (нечетные дорожки) и “внутренними” праймерами (четные дорожки). Дорожки: 1, 2 - положительный контрольный образец; 3, 4 -ДНК, выделенная из клеточного материала мочи пациента с диагнозом CMV-инфекция ЦНС; 5,6 - ДНК здорового донора; М-маркеры ДНК.
Анализ образца ДНК на содержание генома CMV в клеточном материале из мочи ребенка методом гПЦР показал присутствие в образце ДНК CMV (рис. 18). Причем, специфический продукт ГХЦР виден только в случае амплификации с “внутренней” парой праймеров. Данный результат подтверждает большую эффективность анализа ДНК методом гПЦР по сравнению с обычной ПЦР.
4.1.4. Анализ провирусной ДНК HIV1 методом гПЦР
К проблеме СПИД в последнее время приковано самое пристальное внимание ученых и медиков. Использование метода ПНР для анализа провирусной ДНК HIV является важным моментом в диагностике СПИД или “HTV1-инфекции” в связи с низким содержанием вируса в периферической крови (1 копия ДНК HIV1 на 104 геномов хозяина) (Ou C.Y. 3988).
Для анализа провирусной ДНК H3V1 методом гПЦР мы использовали праймеры на область Gag-гена HIV 1.
На рис. 19 представлены результаты анализа провирусной ДНК H1V1 в клетках периферической крови 5 здоровых доноров и 2 пациентов с диагнозом СПИД.
Из рисунка видно, что у здоровых доноров полностью отсутствует провирусная ДНК HIV1. У пациентов с диагнозом СПИД после ПЦР с “внешними” праймерами помимо специфического продукта (297 Ьр), наблюдается присутствие других фрагментов ДНК различной молекулярной