Секреция белков у дрожжей

• Автор: Циоменко, Арнольд Борисович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 73 с.; 20х15 см

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Способность секретировать
разнообразные микро- и макромолекулы - непременное свойство всех живых клеток. Изучение этого свойства занимает одно из центральных мест в современной биологии. Впечатляющие успехи в данной области, безусловно, стали возможными лишь благодаря комплексному исследованию большинства существующих здесь проблем, что подразумевает использование наиболее прогрессивных идей и подходов из смежных областей биохимии, молекулярной биологии, клеточной биологии и генетики.
Секреторный процесс интегрирован многообразными связями в общий клеточный метаболизм, выделяясь при этом своей особой предназначенностью. Используя сложные регуляторные механизмы, позволяющие контролировать не только синтез, но и строго детерминированную адресованную доставку секретируемых компонентов к месту их функционирования, этот процесс обеспечивает биогенез обширной группы макромолекул и надмолекулярных структур, составляющих вместе уникальное клеточное образование, называемое секреторной системой.
Функции секреторной системы чрезвычайно разнообразны. Вместе с тем, наиболее специфические из них эволюционно консервативны и присущи как прокариотическим, так и эукариотическим клеткам. В обоих случаях, экспрессия на клеточной поверхности и экспорт из клеток белков и других биополимеров является основой механизма передачи химических сигналов, определяет характер межклеточных взаимодействий и, в целом, обеспечивает возможность адаптации клеток к сложным условиям среды обитания.
Нельзя не отметить еще одну, пожалуй, наиболее очевидную и одновременно особенно важную роль секреторной системы в построении и функционировании клеточной поверхности эукариотических клеток, к каковым относятся и дрожжи. Так, дрожжевая клетка удваивает площадь своей поверхности в течение одного клеточного цикла. При этом формируется новая клеточная ШЭлочка и практически все её компоненты, в том числе и белки, которые синтезируются и созревают в секреторной системе, а затем -.мспортируются к месту конечной локализации.
;Э . Исследования механизмов секреции белков развиваются быстро и плодотворно. Их начало было положено более двух десятилетий тому назад работами Паллада [1], определившими генеральную схему

предположить, что дрожжи, как экспериментальная модель, вскоре займут, если не лидирующую, то, по крайней мере, одну из центральных позиций в изучении механизмов секреции [2,3].
До недавнего времени устройство секреторной системы дрожжевой клетки представлялось весьма упрощенно и базировалось во многом на аналогии с секреторной системой животных и растительных клеток. Считалось , что низшие эукариоты, к каковым относят дрожжи, располагают редуцированным вариантом секреторной системы высших эукариот. Не существовало прямых доказательств, но допускалось наличие у дрожжей аппарата Гольджи (АГ), равно как и разнообразных везикул, осуществляющих межорганелльный перенос белков. Однако, по мере накопления экспериментальных данных дрожжевая секреторная система приобретала очертания близкие, если не идентичные, секреторной системе высших эукариот.
На сегодняшний день секреторная система дрожжевой клетки представляется состоящей из нескольких индивидуальных органелл (компартментов), связь между которыми осуществляется посредством мембранных везикул [4] . Последние, в зависимости от типов
связываемых ими.компартментов называются либо транспортными, либо секреторными везикулами.
Все секреторные белки начинают свой путь к месту конечной локализации из цитозоля со свободных рибосом, и после
непродолжительного временного интервала (инициация трансляции, синтез сигнального пептида и прикрепление рибосомы к мембране), транслоцируются уже с мембраносвязанных рибосом в люменальное пространство эндоплазматического ретикулюма (ЭР), если белки
растворимые, или встраиваются в мембрану ЭР, если белки имеют
соответствующее предназначение. Дальнейший транспорт и все
модификации секреторных белков происходят в составе мембранных органелл секреторной системы.
Принято считать, что до определенного момента транспорт всех секреторных белков дрожжей происходит совместно, по общему
(конститутивному) пути секреции. На уровне АГ белки, предназначенные для попадания в вакуоль, (аналог лизосом клеток высшие эукариот), отсортировываются и транспортируются в эту
оргавеллу с помощью специальных везикул [51. Остальные белки продолжают свое движение на периферию клетки в клеточную оболочку в составе секреторных везикул.
Наиболее слабым звеном в представлениях о механизме секреции белков у дрожжей является терминальная стадия, в результате

Учитывая важность обнаруженного факта мы тщательно проверили все доступные sec7 мутанты (RSY300 , sec7-4, й-тип спаривания и
RSY301, sec7-4, a-тип спаривания) на способность экспортировать
ГП400 при рестриктивной температуре и дополнительно убедились в том , что выход ГП400 из клеток нечувствителен к указанной мутации. Все это создало возможность использования ГП400 в качестве специфического маркера экспортного потока дрожжей.
Как было сказано выше, в норме ГП400 не накапливался внутри клеток дикого типа. Однако, при блокировке секреции у мутантов seel или sec6 этот белок накапливался в секреторных везикулах. Необходимо было выяснить, является ли ГП400 компонентом ранее охарактеризованных везикул конститутивного пути или его транспорт осуществляется в везикулах другого типа.
С этой целью везикулы, накапливающиеся при 37° были получены препаративно и разделены двумя различными способами: равновесным
центрифугированием в линейном градиенте плотности сахарозы и гель-фильтрацией на сефакриле S1000 (рис. 13, 14).
Конститутивные секреторные везикулы идентифицировали по активности КФ и по наличию в них маркерного гликопротеина gpllO . Дополнительным , кроме ГП400, маркером экспортных везикул служил гормон роста человека (ГР), секрецию которого направлял препросегмент дрожжевого феромона - й-фактора.
Как видно из рис. 13, два маркерных белка - КФ и ГП400 были сосредоточены в разных мембранных фракциях, значительно различающихся по плотности.
Дополнительные доказательства существования двух популяций секреторных везикул были получены и с помощью второго метода -гель фильтрации (рис. 14) В этом случае достигалось более четкое разделение КФ и ГП400. Кроме того, конститутивные секреторные везикулы, несущие КФ были обогащены по gpllO (рис. 15), но не содержали ГП400.
Забегая немного вперед, отметим, что с популяцией везикул, содержащих ГП400 был ассоциирован ГР (рис. 14). Присутствие ГП400 и ГР в отдельной фракции везикул было показано нами и иммуноцитохимическим методом, о чем будет сказано в следующей главе, посвященной экспрессии/секреции ГР под контролем регуляторных элементов гена дрожжевого феромона - й -фактора. Здесь же заметим, что совместная локализация ГР и ГП400 говорила о возможной связи последнего с КЕХ2 компартментом, сосредоточенным в транс-АГ и содержащим максимальную активность