Участие эндогенных протеинкиназ в сезонной регуляции активности Ca-АТРазы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц суслика Spermophilus undulatus

• Автор: Кондрашев-Луговский, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А23187 - кальцимин (кальциевый ионофор)
сАМР - циклический аденозинмонофосфат
cGMP - циклический гуанозинмонофосфат
АТР - аденозинтрифосфат
ADP - аденозиндифосфат
АМР - аденозинмонофосфат
ITP - инозитолтрифосфат
UTP - уридинтрифосфат
СТР - цитидинтрифосфат
DHPR —дигидропиридиновый рецептор, Са2+-канал плазмалеммы DMF - диметилформамид
DRB - 5,6-дихлор-1-бета-0-рибофуранозилбензимидазол DTSP - дитиобиссукцинимидилпропионат DTT - дитиотриэтол
EDTA— этилендиаминотетрауксусная кислота
EGTA - этилендиоксидиэтилендинитрилотетрауксусная кислота
GTP - гуанозинтрифосфат
LDH - лактатдегидрогеназа
MOPS - морфолинопропансульфоновая кислота
NADH - никотинамидадениндинуклеотид
РЕР - фосфоенолпируват
Pi - неорганический фосфат
РК - пируваткиназа
PMSF - феиилметилсульфонилфторид
pNPP — пара-нитрофенилфосфат
RyR - рианодиновый рецептор, Са2+-канал мембраны СР
TRIS - трис(гидроксиметил)аминометан
SDS - додецилсульфат натрия
БСА - бычий сывороточный альбумин
Н89 - 1Ч-2-пара-бромоцинамиламинетил-5-изохинолинсульфонамид
Са-АТРаза; SERCA - Са2+-зависимая АТР-фосфогидролаза мембраны CP
СаМ - кальмодулин
СР - саркоплазматический ретикулум
ТХУ - трихлоруксусная кислота

СОДЕРЖАНИЕ
I. Введение
И. Обзор литературы
II.1. Гибернация млекопитающих
II.2. Регуляция энергетического метаболизма при гибернации
И.З. Регуляция экспрессии генов
II.4. Контроль метаболизма посредством влияния температуры на свойства ферментов
II.5. Регуляция функциональной активности сердца и скелетных мышц при гибернации
II.6. Основные белковые и липидные компоненты мембран СР
II.7. Регуляция функциональной активности СР
II.8. Особенности функционирования СР животных-гибернаторов
III. Цели и задачи
IV. Материалы и методы
IV. 1. Экспериментальные животные
IV. 2. Получение микросомального препарата СР
IV. 3. Определение концентрации белка
IV. 4. Определение активности Са-АТРазы
IV. 5. Определение влияния фосфорилирования белков СР на активность Са-АТРазы СР
IV. 6. Электрофорез в полиакриламидном геле
IV. 7. Фосфорилирование белков СР эндогенными протеинкиназами
IV. 8. Определение уровня фосфорилирования белков СР
IV.9. Авторадиография
IV. 10. Очистка препарата Са-АТРазы аффинной хроматографией на колонке с Reactive RED-120 агарозой
IV. И.Анализ спектра белков, взаимодействующих с Са-АТРазой
IV. 12. Идентификация белков, взаимодействующих с Са-АТРазой
IV. 13. Определение консервативных аминокислотных последовательностей и потенциальных участков фосфорилирования в белках, взаимодействующих с Са-АТРазой

В настоящее время известно большое количество низкомолекулярных лигандов, способных модулировать активность кальциевого канала СР. Так, RyR может активироваться микромолярными концентрациями Са2+, адениловыми нуклеотидами, кофеином, рианодином (в наномолярных концентрациях), ионами тяжелых металлов, окисленным глутатионом, перекисью водорода и другими модификаторами SH-групп. Ингибиторами Са-каналов являются Са2+ и Mg2+ (в миллимолярных концентрациях), рутениевый красный, рианодин (в микромолярных концентрациях), лактат и вещества, восстанавливающие дисульфидные связи в белках (Favero, 1999)
Зависимость активности рианодинового рецептора от концентрации Са имеет вид колоколообразной кривой с максимумом в области 100 мкМ Ca2+(Meissner, 1986).
Са2+-индуцируемый выброс Са2+ активируется миллимолярными концентрациями АТР (Meissner, 1986). Кроме АТР, активирующим эффектом обладают и другие адениловые нуклеотиды (АТР, ADP, АМР, сАМР аденозин, аденин). Активация канала осуществляется за счет связывания нуклеотидов в регуляторных участках (Michalak et al., 1988).
Предполагается, что in vivo основным физиологическим регулятором активности Са-каналов является не АТР, a Mg2+-ATP. Внесение Mg2+ и АТР в концентрациях, близких к физиологическим (5 мМ АТР и Mg2+ и дополнительно 700 мкМ свободного Mg2+) оказывало стимулирующий эффект при индукции выброса Са2+ микромолярными концентрациями Са2+, что свидетельствует о существовании регуляторного участка, при связывании в котором Mg2+-ATP Са-канал становится более чувствительным к активации более низкими концентрациями Са2+ (Meissner, 1986).
Особый интерес представляет вопрос о регулировании активности RyR при помощи белок-белковых взаимодействий, а так же путем активации различных протеинкиназ.
Молекула RyR является мишенью для большого числа различных протеинкиназ. Установлено, что изоформы RyRl и RyR2 фосфорилируются протеинкиназами А, С, G и Са/СаМ-зависимой протеинкиназой (Strand et al