Нуклеозиддифосфаткиназа : особенности взаимодействия с наружной мембраной митохондрий и системой окислительного фосфорилирования

• Автор: Воинова, Вера Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 219 с.

1. Список сокращений
2. Введение
3. Обзор литературы
3.1. Кинетические характеристики и механизм нуклеозиддифосфаткиназной
реакции
3.1.1. Кинетические характеристики нуклеозиддифосфаткиназной
реакции
3.1.2. Роль ионов двухвалентных металлов
3.1.3. Роль 3' гидроксильной группы рибозы
3.1.4. Фосфорилированный интермедиат
3.1.5. Природа переходного состояния нуклеозиддифосфаткиназной
реакции
3.1.6. Альтернативные субстраты и ингибиторы НДФК
3.2. Физико-химические свойства изоформ НДФК
3.2.1. Гены, кодирующие НДФК
3.2.2. Структура НДФК
3.2.3. Локализация, молекулярная масса и изоэлектрические точки
изоформ НДФК
3.2.4. Локализация НДФК в митохондриях
3.3. Роль продуктов нуклеозиддифосфаткиназной реакции в метаболизме
3.4. Вторичные активности НДФК
3.5. Роль НДФК в регуляции внутриклеточных процессов
3.5.1. Участие НДФК в регуляции клеточного цикла
3.5.2. Участие НДФК/яот23 в регуляции процессов дифференциации
3.5.3. Движение и форма клеток
3.5.4. Роль НДФК1пт23 в регуляции метастазирования опухолей
3.5.5. Ген-мугатор Escherichia coli
3.5.6. Участие НДФК в регуляции программируемой клеточной смерти
3.5.7. НДФК/пт23, как фактор регуляции экспрессии генов на уровне
транскрипции
3.5.8. НДФК и сигнальные каскады

3.6. Регуляция проницаемости наружной мембраны митохондрий
3.7. Представление о функциональных компартмснтах и роли киназ
наружного компартмента митохондрий во внутриклеточном транспорте энергии
3.7.1. Компартментация метаболитов и функциональное сопряжение,
определение понятий
3.7.2. Компартментация адсниловых нуклеотидов в межмембранном
пространстве митохондрий во время активности митохондриальной аденилаткиназы
3.7.3. Функциональное сопряжение между активностью
митохондриальной креатинкиназы и системой окислительного фосфорилирования
3.7.4. Функциональное сопряжение активности киназ, локализованных на
внешней поверхности наружной мембраны митохондрий, с окислительным фосфорилированием
4. Цели и задачи исследования
5. Методы исследования
5.1. Материалы
5.2. Выделение митохондрий печени крысы методом дифференциального
центрифугирования
5.3. Полярографический метод регистрации дыхания митохондрий
5.4. Определение скорости окислительного фосфорилирования,
коэффициента дыхательного контроля и активностей НДФК. гексокиназы и аденилаткиназы полярографическим методом
5.5. Выделение митохондрий по методу Ноушь и соавт
5.6. Удаление цитохрома с из митохондрий
5.7. Исследование локализации нмНДФК в наружном компартменте
митохондрий
5.8. Влияние различных веществ на солюбилизацию нмНДФК
5.9. Определение доли связанной с мембранами акгивности нмНДФК в ходе
хранения препарата митохондрий
5.10.Получение препарата митохондрий с низким содержанием нмНДФК

5.11.Полярографические эксперименты в присутствии креатинкиназы
5.12.Обработка проб после полярографического эксперимента
5.13.Определение скорости взаимодействия креатинкиназы с CDP
5.14. Определение времени инкубации проб с хлорной кислотой,
необходимого для полной инактивации ферментов
5.15.Определение степени гидролиза креатинфосфата и ЛТР при обработке
проб хлорной кислотой
5.16.Определение концентрации креатина
5.17.Определение концентраций нуклеотидов, глюкозо-6-фосфата и
креатинфосфата
5.17.1. - Определение концентрации ADP и CDP
5.17.2. Определение концентрации глюкозо-6-фосфата, ATP, СТР и креатинфосфата
5.17.3. Определение концентрации ATP, ADP. АМР, СТР, CDP и UDP на основании коэффициентов их молярного поглощения
5.17.4. Определение чистоты препаратов ATP, ADP и CDP
5.18. Исследование взаимодействия дрожжевой НДФК с мембранами
митохондрий
5.19. Исследование взаимодействия дрожжевой ГК с мембранами
митохондрий
5.20.Обращение солюбилизации нмНДФК добавлением Mg2+
5.21.Сравнение взаимодействия протеиназ с нмНДФК, перешедшей в раствор,
и с компонентами мембран в местах сё связывания
5.22.Влияние pH на прочность взаимодействия нмНДФК с мембранами митохондрий
5.23.Обращение солюбилизации нмНДФК изменением pH среды хранения
5.24.Влияние пальмитиновой кислоты на прочность взаимодействия нмНДФК
с мембранами митохондрий
5.25.Получение экстракта белков с поверхности митохондрий для электрофоретических исследований
5.26.Спектрофотометрическое определение активности гексокиназы и НДФК
в сопряженной ферментной системе

повышаться концентрация ЛМР. Так, известно, что с внешней поверхностью наружной мембраны митохондрий связана ацил-КоА-синтетаза [3, 49]. Этот фермент катализирует реакцию образования ацетоацетил-КоА, в ходе которой АТР расщепляется на АМР и РР; [564]. АМР может диффундировать в межмембранное пространство митохондрий и при участии АТР превращаться там мАК в ADP, который затем используется системой окислительного фосфорилирования.
В связи с вышесказанным встаёт вопрос, может ли возникать существенный градиент концентрации адениловых нуклеотидов между межмембранным пространством митохондрий и экстрамитохондриалыгой средой in vivo, и имеет ли это явление физиологическое значение?
Этот вопрос был рассмотрен на примере митохондрий сердца и скелетных мышц. Известно, что в тканях значительная часть ADP связана с внутриклеточными структурами [26, 402, 502, 543]. Концентрация свободного ADP в цитоплазме миоцитов очень низка, порядка 30 мкМ [471, 502] а в клетках некоторых типов скелетных мышц еще меньше — 1-5 мкМ [184. 250, 391]. Концентрация свободного АТР в цитоплазме миоцитов. напротив, высока (5 - 10 мМ) [26, 255, 290, 494, 502] и поддерживается на постоянном уровне за счёт буферной функции креатинкиназноп системы [566]. Таким образом, по отношению к свободной концентрации каждого из нуклеотидов в цитоплазме, концентрация ADP в межмембранпом пространстве митохондрий в экспериментах Gellerich и соавт. возрастала более чем на 40%, тогда как для АТР этот градиент был ничтожно мал [157].
В лаборатории Bessman было показано [129, 311], что при концентрации АТР в среде около 500 мкМ, степень его компартментации в межмембранном пространстве митохондрий сердца во время окислительного фосфорилирования не превышает 10-12%. Таким образом, уже при концентрации АТР в среде порядка 500 мкМ диффузионные ограничения не могут привести к сколько-нибудь существенной компартментации АТР.
Можно предположить, что in vivo градиент концентрации адениловых нуклеотидов между межмембранным пространством и цитоплазмой может быть выше, чем это найдено в опытах in vitro. Известно, что митохондрии, изолированные в среде с низким онкотическим давлением, характеризуются увеличенным объёмом межмембранного пространства и резким уменьшением числа контактных участков