Влияние каротиноидов на обмен холестерина в клетках человека in vitro

• Автор: Малахова, Майя Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 98 с. : ил.

ОГ ДАВЛЕНИЕ

Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Каротиноиды -многофункциональные соединения
1.2. Метаболизм каротиноидов в организме
1.3. Биологическая активность каротиноидов
1.3.1. Антиоксидантное действие каротиноидов
1.3.2. Антиканцерогенное действие каротиноидов
1.3.3. Каротиноиды и сердечно-сосудистые заболевания
1.3.4. Каротиноиды и обмен холестерина
1.4. Окисленные производные р-каротина
1.5. Клеточные культуры - экспериментальные модели
для изучения каротиноидов
1.6. Способы солюбилизации каротиноидов
Глава 2. Материалы и методы исследования
Глава 3. Результаты и обсуждение собственных исследований
3.1. Исследование свойств различных форм солюбилизации каротиноидов
3.1.1. Липосомальная форма каротиноидов
3.1.2. Водорастворимая форма каротиноидов, стабилизированная Проксанолом
3.2. Изучение влияния каротиноидов на содержание и биосинтез холестерина в клетках культуры
3.3. Изучение окисленных производных р-каротина
3.3.1. Биологическая активность продуктов
автоокисления р-каротина
3.3.2. Выделение, характеристика и биологическая активность продуктов, образующихся в результате окисления Р-каротина с радикальным инициатором
3.3.3. Идентификация билогически активных продуктов окисления р-каротина
Глава 4 Заключение
Выводы
Список литературы
Список сокращений.
АІВИ- азо-бис-изобутиронитрил
вэжх- высокоэффективная жидкостная хроматография
лвп- липопротеины высокой плотности
лнп - липопротеины низкой плотности
лонп липопротеины очень низкой плотности
лпс - липосомы
ПАВ- поверхностно-активные вещества
пол- перекисное окисление липидов
СФ-метрия - спектрофотометрия
ТГФ- тетрагидрофуран
ТСХ- тонкослойная хроматография
ФЛ- фосфолипиды
ФХ- фосфатидилхолин
хс- холестерин
ЭТС- эмбриональная телячья сыворотка
УЗ- ультразвук

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования.
Каротиноиды - природные пигменты, изопреноидной природы, которые синтезируются растениями [Бриттон, 1986] и микроорганизмами [Феофилова, 1974]. В организме человека и животных каротиноиды не синтезируются de novo, а поступают с растительной пищей. Ранее в исследованиях биологической роли каротиноидов в организме человека и животных доминировала «провитаминная концепция», согласно которой эти пигменты рассматривались как предшественники витамина А [Goodwin, 1952, Goodwin, 1980]. В последние годы изучение каротиноидов позволило сформулировать концепцию об их биологических невитаминных функциях в организме человека и животных [Olson, 1989]. Опубликованы результаты исследований, демонстрирующие роль каротиноидов в регуляции иммунного ответа [Bendich, 1989], в уменьшении риска онкологических заболеваний [Albanes et al., 1995], увеличении устойчивости к радиации [Беляев с соавт., 1992], профилактике заболеваний сердечно-сосудистой системы [Gaziano et al., 1992].
Антиатерогенное действие каротиноидов установлено в ряде эпидемиологических исследований [Eicholzer et al., 1992; Gey et al., 1993]. Данный эффект принято связывать с их антиоксидантными свойствами и, прежде всего, с защитой ЛНП от окисления свободными радикалами [Jialal et al., 1991]. Известно, что окисление ЛНП является важным фактором в патогенезе атеросклероза [Лопухин и др., 1983]. Исследования последних лет указывают на возможность существования других механизмов антиатерогенного действия каротиноидов. В ряде работ показано, что высокое содержание p-кароткна в диете снижает степень поражения сосудов, но при этом не защищает ЛНП от окисления [Shaish et al., 1995]. Появились данные о влиянии изокреноидных продуктов на активность ОМГ-КоА-редуктазы - ключевого фермента биосинтеза холестерина в животных клетках [Brown & Goldstein, 1980]. Недавно было показано, что Р-каротин ингибирует экспрессию ОМГ-КоА-редуктазы в печени крыс по пост-транскрипционному механизму, снижая трансляцию м-РНК фермента [Moreno et al., 1995], одновременно снижая содержание холестерина в ЛНП [Elson & Qureshi, 1995]. Эти данные подтверждают предположение о непосредственном влиянии каротиноидов на обмен холестерина в животных клетках.
Изучение биологической активности каротиноидов имеет ряд трудностей, обусловленных строением молекулы этих веществ. В основе структуры этих углеводородов лежит полиеновая цепь сопряженных двойных связей, которая определяет два важных химических свойства молекулы каротиноида : гидрофобность и реакционноспособность

вакуумом и перерастворяли в необходимом для дальнейшего анализа растворителе [Нага & R.adin. 1978].
Липиды из каротиноид-фосфатидилхолиновых липосом экстрагировали смесью хлороформ:метанол (2:1) по методу [Folch et al., 1957].
Каротиноиды из водной дисперсии и из среды культивирования экстрагировали следующим образом : отбирали аликвоту обьемом 40-100мкл, добавляли 0,6мл этанола и 3 мл гексана или петролейного эфира. После перемешивания добавляли Змл дистиллированной воды и центрифугировали при 1,6 Tbic.g в течение 5 мин. Гексановую фракцию отбирали для последующего спектрофотометрического определения концентрации каротиноидов.
2.6. Тонкослойная хроматография липидов
Экстракты липидов перерастворяли в небольшом объеме хлороформа и наносили на пластины Keiselgel 60 F-254 "Merck". Разделение липидов, экстрагированных из липосом, проводили в системе растворителей гексан:диэтиловый эфир:метанол:ледяная уксусная кислота (9:2:0,2:0,3) [Кейтс, 1975]. Разделение общих липидов проводили в системе растворителей гексан: диэтиловый эфир: ледяная уксусная кислота (7:3:0,1) [Нага & Radin, 1978], Проявление хроматограмм проводили в парах йода. Для этого пластины после разделения высушивали на воздухе и помещали в эксикатор с кристаллами йода на 3-5 мин.
Элюирование каротиноидов проводили в системе растворителей хлороформ :метанол (3:2). Элюирование фосфолипидов проводили в системе растворителей хлороформ : метанол : 14N NH4OH (5,6:4,2:0,2).
2.7. Определение содержания фосфолипидов
Определение фосфолипидов проводили по неорганическому фосфору [Vaskovsky et al., 1975]. Элюат, содержащий фосфолипиды, упаривали на водяной бане при температуре 50°С, а затем разлагали в присутствии НС104 при нагревании. В качестве стандарта при построении калибровочной кривой использовали раствор КН2Р04 в пределах от 1мкг до 5мкг фосфора в пробе.
2.8. Определение концентрации каротиноидов
Определение концентрации каротиноидов проводили спектрофотометрически по поглощению экстракта каротиноида в гексане или петролейном эфире, используя коэффициент экстинкции (Ei'c*M) 2550 при длине волны 451 нм для 1% раствора Д-каротина и 3450 при длине