Разработка векторов для молекулярного клонирования с позитивной селекцией, основанных на использовании летального эффекта гена барназы

• Автор: Язынин, Сергей Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список использованных сокращений
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1.1. Вектора с позитивной селекцией
1.2. РНКаза барназа как фактор летальности
1.2.1. Характеристика фермента
1.2.2. Внутриклеточный ингибитор барназы — барстар
ГЛАВА 2 Материалы и методы
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Разработка на основе гена барназы вектора
рМТ440 с позитивной селекцией
3.1.1. Изучение влияния уровня индукции tac — промотора на выживаемость различных штаммов E.coli,
трансформированных плазмидой рМТ416
3.1.2. Клонирование с помощью плазмиды рМТ416 ПЦР— продукта,
кодирующего вариабельные регионы легкой цепи антитела к белку р24 вируса HIV
3.1.3. Введение полилинкера в ген барназы и конструкция векторов рМТ438, рМТ438а и рМТ440
3.1.4. Использование вектора рМТ440 с позитивной селекцией для клонирования фрагментов чужеродной ДНК
3.2. Конструирование вектора рВа —7 с позитивной селекцией
3.2.1. Конструирование плазмид рВа — 2, рВа — 3s и рВа

3.2.2. Сайт — специфический мутагенез для удаления .повторяющихся
сайтов рестрикции и конструкция вектора рВа
3.2.3. Использование вектора рВа — 7 для клонирования фрагментов чужеродной ДНК
3.2.4. Использование вектора рВа — 7 для клонирования генов иммуноглобулинов мыши
3.3. Исследование с помощью иммуноблотинга рекомбинантной барназы и ее мутантов, продуцируемых с помощью плазмид рМТ440 и рВа
3.4. Характеристика вклада ряда мутаций в ферментативную активность модифицированной барназы
Заключение
ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Список литературы

Список использованных сокращений
В* — барстар
Ва — рибонуклеаза барназа
САР — транскрипционный фактор, регулирующий траскрипцию генов, ответственных за катаболизм в клетке E.coli
ccdB — ген белка CcdB — ингибитора топоизомеразы II E.coli, регулирующего жизнеспособность бактериальных клеток, утративших F' — эписому.
ccdA — ген белка CcdA, ингибирующего активность белка CcdB в клетках E.coli.
Da(kDa) — дальтон (килодальтон)
DEPC — диэтилпирокарбонат
dNTP(s) — дезоксирибонуклеотидтрифосфат(ы)
DTT — дитиотритол
ЕСЕРР/3 — обозначение базового алгоритма для работы со структурами белков методом Монте Карло
GATA—1 — транскрипционный фактор, распознающий консенсус — последовательность GAT(A).
GpN — гуанозил—3',5'— нуклеозид
GpU — гуанозил—3',5' —уридинмонофосфат
GST — глутатион — S — трансфераза
HIV— 1 — вирус иммунодефицита человека
ICM — internal coordinates modeling, компьютерная программа для
моделирования структуры белков
Kd — константа диссоциации
ККат ~ каталитическая константа
Кт _ константа Михаэлиса
7асН —ген Lac —репрессора
М —MuLV обратная транскриптаза — обратная транскриптаза из вируса мышиной лейкемии Moloney
MOPS — 3— (N — морфолино) пропан сульфоновая кислота ОтрА — сигнальный пептид мембранного белка OmpA E.coli

Asp39 и остатками активного центра барназы Arg83, Ахд87 и His 102. Введение мутации Asp35Ala в В* увеличивает k_i в 1000 раз.
Анализ структуры комплекса Ва —В* (Cys42,80 Ala) дает возможность более детально изучить роль различных взаимодействий при образовании белок — белковых ассоциатов [66, 73]. В* ингибирует Ва путем стерического блокирования активного центра а — спиральку и сегментом смежной петли. Половина из 14 водородных связей, присутствующих в участке связывания между Ва и В*, образованы парами заряженных остатков и треть — парами, где хотя бы одна из кислот заряжена [93]. При связывании с ингибитором два фосфат — связывающих участка в активном центре Ва оказываются занятыми остатками Asp39 В* и Gly43 В*. Наибольшие изменения в скорости водородно — дейтериевого обмена наблюдаются для остатков, находящихся в активном центре и в субстрат — связывающей петле [76]. Таким образом, связывание с Ва индуцирует структурные перестройки в молекуле белкового ингибитора [93].