Изучение взаимодействия белка VPR вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) с клеточными структурами и белками ВИЧ-1 в процессе формирования вирусоподобных частиц

• Автор: Чикова, Анна Константиновна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
Общие сведения
1.2. Vpr - вспомогательный белок ВИЧ
1.3. Структура и свойства белка
1.4. 2 Взаимодействие Vpr с белками ВИЧ
1.5. 2 Взаимодействие Vpr с клетками
1.5.1. Взаимодействие Vpr с клеточными мембранами
1.5.2. Особенности внутриклеточного транспорта белка Vpr. Взаимодействие с клеточными белками и нуклеиновыми кислотами
1.6. 2 Влияние Vpr на инфицированные клетки
1.6.1. Торможение клеточного цикла на
стадии G2/M
1.6.2. Активизация механизма апоптоза, индукция дифференциации клеток в присутствии Vpr
1.7. Функции белка Vpr в жизненном цикле ВИЧ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Культивирование бактериальных штаммов
2.1.1. Использованные штаммы бактерий Escherichia coli
2.1.2. Питательные среды

2.2. Культивирование клеток насекомых и вируов
2.2.1. Культивирование клеток насекомых
1. Культуры клеток
2. Условия культивирования
2.2.2. Вирусы
2.3. Получение рекомбинантных штаммов
2.3.1. Полимеразная цепная реакция
1. Праймеры для амплификации vpr
2. Условия реакции
2.3.2. Получение рекомбинантных штаммов Escherichia coli
1. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток
а. Экспресс-метод
б. Препаративное выделение плазмидной
ДНК с помощью горячей щелочи
2. Рестрикция
3. Электрофоретическое разделение
препаратов ДНК
4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного
геля
5. Лигирование
6. Приготовление компетентных клеток E. coli и трансформация их препаратами плазмидной ДНК
7. Селекция рекомбинантных клонов
2.3.3. Получение рекомбинантных вирусных штаммов

1. Получение вирусной ДНК.

2. Трансфекция
3. Селекция рекомбинантных клонов
2.4. Получение белковых препаратов
2.4.1.Получение препаратов клеток
2.4.2. Фракционирование клеток
2.4.3. Выделение ВПЧ
2.4.4. Подготовка препаратов для анализа
2.5. Анализ белковых препаратов
2.5.1. Электрофорез
2.5.2. Иммуноблот
2.6. Синтез и очистка 1Ч-концевого пептида белка Ург
2.7. Получение иммунной сыворотки к белку Ург с использованием синтетического пептида
2.7.1. Иммунизация кроликов
2.7.2. Методика ИФА
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование рекомбинантных плазмид
3.1.1. Получение фрагмента ДНК гена ург и
конструирование рекомбинантной плазмиды риСург
3.1.3. Конструирование инсерционных плазмид
1. Конструирование инсерционной
плазмиды р VI, ург
2. Конструирование инсерционной плазмиды рАСург

реход со стадии G на М регулируется комплексом p34cdc2 с цикли-ном В. На поздней стадии G2, при высоком уровне циклина В происходит дефосфорилирование в области аминокислотных остатков Т14, Т15, и CDK активируются. Таким образом запускается М-фаза. При экспрессии Vpr в клетках наблюдается почти полное подавление р34сбс2киназной активности, в результате чего фракция молекул с фосфорилированными ингибиторными сайтами заметно увеличивается.
Poon et al. 1997, предположили, что накопление гиперфосфори-лированной формы с<1с2киназы, характерное для G2apecra, индуцированного Vpr, идентично воздействию на клетки ДНК-по-вреждающих агентов, также способных тормозить клетки на стадии G2/M. Воздействие на клетки одного из таких агентов — HN2 — может быть нейтрализовано метилксантинами. Интересно, что добавление метилксантинов в культуральную среду клеток, экспрессирующих Vpr, приводит к возвращению клеточного цикла к нормальному состоянию. Таким образом, по данным Poon et al. 1997, G2apecT может являться следствием нарушения процессов репарации ДНК в присутствии Vpr. Некоторые авторы предполагают, что торможение клеточного цикла на стадии G2/M может быть следствием взаимодействия Vpr с ферментами репарации ДНК: урацил ДНК-гликозилазой [Bouhamdan et al. 1996] и фактором HHR23A [Withers-Ward et al. 1997].
Большой интерес для изучения механизмов взаимодействия Vpr с клеткой представляет исследование гомологов Vpr ВИЧ2 и некоторых групп SIV. Белок Vpx не обладает способностью к G2apecTy клеток млекопитающих, тем не менее, при экспрессии этого белка на модели Saccharomyces cerevisiae наблюдается значительное подавление роста колоний и существенные морфологиче-