Ксиланаза Penicillium Canescens: выделение гена, изучение его регуляции и создание штамма-продуцента

• Автор: Серебряный, Всеволод Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с.

Оглавление
Введение.

Список сокращений, использованных в работе.

1. Обзор литературы.

1.1 Структура полисахаридов растительных клеточных стенок

1.1.1. Целлюлоза

1.1.2. Лигнин.

1.1.3. Гемицеллюлозы

1.1.3.1. РГлюканы

1.1.3.2. Ксилоглюкан

1.1.3.3. Ксилан.

1.1.3.4. Галактоманнан, галактоглюкоманнан.
1.1.4. Пектин.
1.2. Кснланазы мицелиальных грибов
1.2.1. Молекулярная масса.
1.2.2. Температурный и оптимум грибных ксиланаз, классификация
1.2.3. Субстратная специфичность и продукты расщепления.
1.2.4. Побочные активности грибных ксиланаз.
1.2.5. Структура ксиланаз и семейства.
1.2.6. Аминокислотные последовательности грибных ксиланаз и структуры кодирующих их генов
1.2.7. Посттрансляционная модификация ксиланаз
1.3. Регуляция транскрипции генов ксиланаз мицелиальных
1.3.1. i
1.3.2. Регуляторы транскрипции ксиланазных генов i X и СгеА.
1.3.3. Координированная экспрессия арабиназных генов . i.
1.3.4. i.
1.3.5. Регуляторы транскрипции ксиланазных генов . i
1.3.6. Регуляция промотора хупI Т. i.
1.3.7. Регуляция промотора хуп2 Т. i.
1.3.8. iii
1.3.9. Регуляция транскрипции генов ксиланаз в зависимости от
среды.
1.4. . 8 ВКПМ.
2. Материалы и методы
2.1. Реактивы, плазмидные вектора, ферменты и материалы.
2.2. Бактериальные и грибные штаммы, их культивирование.
2.3. Общие методы.
2.4. Исследование ростовых характеристик грибов.
2.5. Электрофоретическое разделение белков
2.6. Получение аРмеченных фрагментов ДНК
2.7. Выделение ДНК из грибного мицелия
2.8. Выделение РНК из грибного мицелия
2.9. Обратная транскрипция РНК и ОТПЦР.
2 Электрофорез РНК и перенос на нейлоновую мембрану.
2 Гибридизация
2 Плазмидная трансформация Е. i
2 Скрининг фаговой библиотеки генов и анализ ДНК рекомбинантных фагов
2 Трансформация гриба iii .
2 Компьютерные программы для анализа нуклеотидных последовательностей ДНК.
2 ПЦР с использованием грибных спор в качестве матрицы.
2 Измерение активностей ферментов
2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2 Клонирование x . .
2 Получение кДНК x и определение ее нуклеотидной последовательности
2 Определение числа копий x в геноме мультикопийного продуцента
2 Клонирование x . .
2 Делеция x.
2 Синтез праймеров для амплификации фрагмента гена уактина
. .
3. Результаты и их обсуждение
3.1. КсиланазаА
3.1.1. Клонирование гена, кодирующего мажорную эндо1,4бетаксиланазу iii .
3.1.2. Определение структуры x
3.1.4. Сравнение свойств ксиланазы, производимой однокопийным и мультикопийным штаммами.
3.1.5. Индукция синтеза ксиланазы мицелиальным грибом
. .
3.1.6. Влияние суперпродукции ксиланазы на продукцию других внеклеточных ферментов
3.2. Ксиланаза В.
3.3. Клонирование гена . , кодирующего регулятор
транскрипции кснланолитичсских генов.
3.3.1. Анализ геномной ДНК . и клонирование гена
3.3.2. Влияние делеции и амплификации x на продукцию ксиланазы и рост штамма.
3.3.3. Роль х1пЯ в регуляции продукции других ферментов.
3.3.4. Транскрипция дглЯ.
Выводы.
Список литературы


Регуляторы транскрипции ксиланазных генов . Регуляция промотора хупI Т. Регуляция промотора хуп2 Т. среды. . 8 ВКПМ. Реактивы, плазмидные вектора, ферменты и материалы. Бактериальные и грибные штаммы, их культивирование. Общие методы. Исследование ростовых характеристик грибов. Обратная транскрипция РНК и ОТПЦР. Электрофорез РНК и перенос на нейлоновую мембрану. Плазмидная трансформация Е. Трансформация гриба iii . Компьютерные программы для анализа нуклеотидных последовательностей ДНК. ПЦР с использованием грибных спор в качестве матрицы. Клонирование x . Клонирование x . Делеция x. . . Клонирование гена, кодирующего мажорную эндо1,4бетаксиланазу iii . Сравнение свойств ксиланазы, производимой однокопийным и мультикопийным штаммами. . . Ксиланаза В. Клонирование гена . Анализ геномной ДНК . Влияние делеции и амплификации x на продукцию ксиланазы и рост штамма. Роль х1пЯ в регуляции продукции других ферментов. Транскрипция дглЯ. Выводы. Список литературы. Введение. Человек давно использует ферменты мицелиальных грибов для обработки различного сырья. Однако, на протяжении долгого времени это использование ограничивалось небольшим количеством технологических процессов, таких как производство соевого соуса или сыра. В последние десятилетия, в связи с интенсификацией технологических процессов и с развитием новых технологий переработки растительного сырья и охраной окружающей среды, появилась потребность в получении ферментных препаратов с заданными свойствами. В связи с этим повысился интерес к молекулярной биологии грибов, как природных продуцентов гликолитических ферментов. Следует отметить, что изучение синтеза внеклеточных ферментов мицелиальными грибами объясняется не только растущей потребностью современной промышленности в этих ферментах, но и тем, что это удобная модель для изучения регуляции транскрипции эукариотических генов и секреции белков. Являясь одними из простейших эукариотических организмов, мицелиальные грибы представляют собой удобный объект для изучения. Многие их виды быстро растут, не требуют сложных питательных сред, и для них разработаны относительно простые способы генетической трансформации. Одним из ферментов, находящих все большее применение в современной промышленности, является эндо1,4рксиланаза эндоксиланаза, ксиланаза фермент, расщепляющий главную цепь ксилана на ксилоолигосахариды. Возможно применение ксиланазы, совместно с другими ферментами, для утилизации растительных отходов, таких как солома, опилки, и прочее. В настоящее время основными продуцентами ксиланаз грибного происхождения являются грибы родов i и i. В то же время, постоянно ведется поиск новых продуцентов, вызванный потребностью в ферментах с улучшенными свойствами, и желанием расширить спектр существующих продуцентов. Объектом нашего исследования был выбран мицелиальный гриб iii ВКПМ 8, первоначально выделенный как природный продуцент Мы поставили перед собой задачу определить пути увеличения продукции эндо1,4Рксиланазы этим организмом, и оценить возможность создания на его основе промышленного штамма продуцента. Создание современных продуцентов является комплексной задачей, и одним из первых этапов этой работы является клонирование генов, кодирующих целевой фермент. Другим подходом к повышению продукции целевого фермента является изучение регуляции транскрипции кодирующего его гена. В некоторых случаях увеличение внутримолекулярной концентрации индуктора и регуляторного белка приводит к повышению транскрипции гена целевого фермента. . 8, и определить его роль в продукции других ферментов этим организмом. Список сокращений, использованных в работе. ОТПЦР ПЦР, использующая в качестве матрицы продукт обратной транскрипции мРНК п. ПЛАГ полиакриламидный гель КМЦ карбоксиметилцеллюлоза ТХУ трихлоруксусная кислота БЭБ додецилсульфат натрия с АТР дезоксиаденозинтрифосфат с