Инженерия гомотримерных фибриллярных белков

• Автор: Мирошников, Константин Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
Глава I. Введение
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цели и задачи исследования
1.3. Научная новизна и практическая ценность
1.4. Основные положения, выносимые на защиту
1.5. Апробация работы
I.7. Объем и структура работы
Глава П. Обзор литературы
II. 1. Фибриллярные адгезины бактериофага Т4
II. 1.1. Длинные хвостовые фибриллы (ДХФ)
II. 1.1.1. Функциональная роль
II. 1.1.2. Характеристика белкового комплекса длинных хвостовых фибрилл
II. 1.1.3. Структурная характеристика белков длинных хвостовых фибрилл
II. 1.2. Короткие хвостовые фибриллы (КХФ)
II. 1.2.1. Функциональная роль
II. 1.2.2. Молекулярная организация
II. 1.3. Фибритин бактериофага Т4
II. 2. Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (CAT): модель для изучения фолдинга
белка и стабилизации структуры
II. 3. Бета-спиральные белки
11.3.1. Общие сведения о |3-спиральных белках

II.3.2. Свойства ß-спиральной структуры
И.З.З. Факторы стабилизации ß-спиральной структуры
11.3.4. Петли и спирали как минорные элементы ß-спиральных белков. Роль этих участков в функциональной активности белка
11.3.5. Предполагаемые белки с ß-спиральной структурой
и их функции
Глава Ш. Материалы и методы
III. 1 Бактериальные штаммы
HI.2 Среды для выращивания бактерий
111.3 Векторы для клонирования. Плазмиды
111.4 Ферменты
III. 5 Полимеразная цепная реакция
111.6 Выделение и очистка ДНК
111.6.1. Очистка амплифицированных фрагментов
111.6.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК
111.6.3. Очистка линеаризованной плазмидной ДНК
111.7 Приготовление компетентных клеток K.coli
III. 8 Трансформация компетентных клеток E
плазмидной ДНК
III.9 Селекция клонов, содержащих рекомбинантные
Плазмиды
III. 10 Экспрессия клонированных генов в E. coli
III. 11 Проверка экспресии в клетках и растворимости
синтезированных белков
III. 12 Выделение и очистка белков

III. 12.1. Выделение растворимых белков
III. 12.2. Очистка белков на основе фибритина ES
III. 12.3. Очистка белков на основе фибритина ТВ1
Ш.12.4.0чистка рекомбинантных белков gpl2N2 и gpl2N3
III. 12.5. Очистка растворимого рекомбинантного белка gpl2N4
III. 12.6. Выделение и рефолдинг белка gpl2Nl
III. 12.7. Очистка белка gpl2FN
III 12.8. Выделение белков gpAd-FA, gpAd-FB, gpAd-FC70
III. 12.9. Выделение и очистка белка CAT-FbrE
III. 13. Определение концентрации белка
III. 14. Определение олигомерности белка
III. 15. Ограниченный протеолиз
III. 16. Спектроскопия кругового дихроизма (КД)
III. 17. Электронная микроскопия
Глава IV. Результаты исследования и их обсуждение
IV. 1. Клонирование и экспрессия фрагментов генов 12 и 37 бактериофага Т4

IV.2. Выделение, очистка и исследование растворимых делеционных мутантов gpl2Nl-gpl2N4
IV.3. Конструирование химерных белков, содержащих фрагменты gpl2, gp34 и gp37 бактериофага Т4 в качестве С-концевого продолжения фибритина
1У.3.1. Выделение, очистка и свойства химер на основе фибритина Е с переходным сайтом $рЪ (серия конструкций рУЕ8)

эти белки либо в отдельный подкласс спиральных белков [60], либо в особый структурный тип [48].
Рис. 13. Схематическая ленточная диаграмма четырехтяжевой ß-спирали рамногалактоуроназы A Aspergillus aculeatus (RG-аза А), ß-тяжи обозначены стрелками, а а-спиральные участки - спиралями [73|.
Рис. 14. Схематическая ленточная диаграмма левой трехтяжевон ß-спирали UDP-N-ацетилглюкозамин-ацилтрансфсразы E. coli, ß-тяжи обозначены стрелками, а а-спиральные участки - спиралями [76].
11.3.2. Свойства ß-спиральной структуры
Каждая структурная единица спирали, впервые найденной в пектатлиазе С Er. chrysanthemi, а впоследствие и в других пектатлиазах, пертактине Р69 и белке хвостового шипа Р22, состоит из трех параллельных ß-тяжей. Если один или несколько ß-тяжей