Роль механизма РНК-интерференции в регуляции экспресии теломерных ретротранспозонов Drosophila melanogaster

• Автор: Шпиз, Сергей Григорьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Содержание
Содержание
Введение

Список сокращений

Обзор литературы

Структурнофункциональная организация теломер i

Структура теломерыых ретротранспозонов

Регуляция длины и поддержание структуры теломер i

Механизмы РНК интерференции

i, и их белкипомощники

Семейство белков

Роль РНКхеликаз в РНКинтерференции
Другие РНКсвязывающие белки в составе I
Механизм образования i
Материалы и методы
Лабораторные линии i и линии культу р клеток, использованные в работе
Выделение геномной ДНК
Выделение РНК
Полуколичественный
РНК i i гибридизация
Нозернблот анализ тотальной РНК i
Нозернблот анализ коротких РНК i
Сочетание методов РНК, ДНК 1 и иммуноокрашивания
Стандартные генноинженерные методики
5 i ii анализ
Клонирование промоторной области рсгротранспозона НеТА для измерения ее активности
Трансфекция культуры клеток i и количественное определение активности галактозндазы
Вестернанализ
Получение экспрессирующих конструкций и конструкций для Рэлементной трансформации
Окрашивание тканей на галактозидазу. Количественное определение активности галактозидазы
Результаты
Короткие РНК теломерных ретротранспозонов в мутантах iII пути
Регуляция экспрессии в мутантах i пути
Исследование экспрессии гена генареиортера, находящегося под контролем НеТА и элементов
Экспрессия репортерного гена , находящегося под промотором НеТА и расположенного в области теломеры, контролируется генами i пути
Экспрессия репортерного гена , находящегося под промотором НеТА и расположенного в эухроматине, контролируется генами i пути
Антнсмыслован транскрипция теломерных ретротранспозонов i
Картирование антисмыслового промотора НеТА
3 область НеТА обладает промоторной активностью в антнсмысловом направлении
Анализ антисмысловой экспрессии теломерных ретротранспозонов
Особенности локализации транскриптов ИеТА и в ядре
Обсуэвдение
Выводы
Список литературы


Черная точка указывает место расположения центромеры. Показаны схемы строения теломерных ретроэлементов i черные стрелки обозначают промоторы и направление транскрипции с них, овалы соответствуют рамкам считывания белков и . Транспозиции теломерных элементов i происходят, видимо, по механизму встраивания I транспозонов. Об этом говорит то, что все теломерные ретротранспозоны ориентированы голова к хвосту и то, что все они обладают длинным полиА хвостом. I транспозоны используют в качестве затравки для синтеза ДНК на матрице РНК Зконец, который образуется в результате эндонуклеазного расщепления ДНК. Теломерные ретротранспозоны i, предположительно, в качестве затравки могут использовать 3 выступающий конец хромосомы. Механизм сайтспецифических транспозиций теломерных ретроэлементов на конец хромосомы пока неясен. Возможно, белок определяет транспорт транскриптов НеТА и в область теломеры. На культуре клеток было показано, что белки теломерных ретротранспозонов НеТА и могут проникать в ядро, в отличие от белков других ретротрансозонов v . Болес того, белок НеТА специфически связывается с теломерами v . При совместной экспрессии белки НеТА и колокализуются на теломерах, притом, что белок ТАТ сам по себе лишен сродства к теломерам v . Экспрессия НеТА и ТАКТ элементов сильно различается. Для НеТА было показано наличие только смысловых транскриптов, причем детектируются транскрипты, превышающие по длине размер копии НеТА. РНК объясняют сквозной транскрипцией нескольких, следующих друг за другом элементов НеТЛ iv . Интересной особенностью НсТА является расположение смыслового промотора в 3об ласт и так, что промотор одной копии определяет транскрипцию последующей копии iv . Для детектированы как смысловые, так и антисмысловые транскрипты, причем последних в раз больше по результатам Нозернаналнза iv . Смысловой и антисмысловой промоторы предположительно локализованы в 5 и 3 нетранслируемых областях элемента, соответственно. Также различным для и НеТА ретротранспозонов является распределение транскриптов между ядерным и цитоплазматическим компартментами. транскрипты преимущественно сосредоточены в ядре, в то время как транскрипты НеТА представлены как в ядре, так и в цитоплазме iv . Транскрипты НеТА обнаруживался в активно делящихся клетках, например, в клетках имагинальных дисков и мозгов у личинок i . Элемент I был недавно открыт в результате анализа геномного сиквенса теломер дрозофилы, поэтому пока отсутствует информация о регуляции его экспрессии, более того, пока не было детектировано присоединений к концу хромосомы. В состав теломер наряду с полноразмерными геломерными ретротранспозонами входят их копии, усеченные с 5конца. Обогащение теломер неполноразмерными копиями может объясняться их терминальной локализацией и особенносгями механизма перемещения самих теломерных ретротранспозонов. Так находящийся на конце хромосомы транспозон будет укорачиваться за счет концевой недорепликации до тех пор, пока не произайдет следующее присоединение. Также возможно образование укороченного ретротранспозона за счет прерывания обратной транскрипции. Конверсия является одним из способов удлинения теломеры и также может приводить к появлению усеченных копий iiv . Полноразмерные копии НеТА, и найдены только в теломерах, но укороченные копии НеТА и также найдены на хромосоме и в центромерной области . Последовательности из Зиекодирующих областей НеТА и формируют протяженный гетерохроматиновый участок хромосомы, что может говорить о возможной их функции и в формировании теломерного хроматина. Однако ген i в составе трансгенных конструкций, попавших в повторы теломерных ретротранспозонов в области теломеры, не подвергается сайленсингу .