Молекулярно-вирусологическое исследование вируса иммунодефицита человека на ранней фазе эпидемии ВИЧ/СПИД

• Автор: Козлов, Андрей Петрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 257 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность проблемы
1.2. Цели и задачи исследования
1.3. Основные положения, выносимые на защиту
1.4. Научная новизна работы
1.5. Практическая ценность
1.6. Личный вклад соискателя
1.7. Форма выполнения диссертационной работы
1.8. Апробация работы
1.9. Публикации
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Обнаружение вируса - возбудителя синдрома приобретенного иммунодефицита
2.2. Общая характеристика пандемии ВИЧ/СПИД
2.3. Свойства вируса иммунодефицита человека
2.3.1. Гены и белки ВИЧ
2.3.2. Фенотипические характеристики изолятов ВИЧ
2.3.3. Вариабельность ВИЧ
2.2.3.1. Мутационная изменчивость генома ВИЧ
2.2.3.2. Селекция вариантов ВИЧ в вирусной популяции
2.3.3.3. Особенности структуры поверхностного белка gpl20 ВИЧ
2.3.3.4. Основной нейтрализуемый домен
2.3.3.5. Субтипы ВИЧ-1 и методы их определения
2.3.4. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции
2.4. Патогенез ВИЧ-инфекции и СПИДа
2.4.1. Взаимодействие ВИЧ с организмом-хозяином
2.4.2. Взаимодействие ВИЧ с условно-патогенными организмами
2.4.3. ВИЧ и вирусы группы герпеса

2.5, Эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции
и молекулярная эпидемиология ВИЧ
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1.1. Подготовка сывороток
3.1.2. Определение антител к ВИЧ методом иммуноферментного анализа (ИФА)
3.1.3. Исследование качества лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции
3.1.4. Серотипирование ВИЧ
3.1.4.1. ИФА с использованием синтетических пептидов
3.1.4.2. Химический синтез УЗ-пептидов ВИЧ и их конъюгатов
сполилизином (МАП-систем)
3.1.4.3. Методы анализа многомерных данных
3.1.5. Выделение вируса иммунодефицита человека
3.1.5.1. Выделение мононуклеарных клеток крови
3.1.5.2. Культивирование лимфоцитов
3.1.5.3. Заражение клеток вирусом
3.1.5.4. Определение активности обратной транскриптазы
3.1.5.5. Определение вирусного антигена в культуральной жидкости
3.1.5.6. Электронная микроскопия
3.1.6. Определение (CD4+)- и (С08+)-субпопуляций Т-лимфоцитов
и В-лимфоцитов (CD20+)
3.1.7. Выделение нуклеиновых кислот из клеток ВИЧ-инфицированных пациентов
3.1.7.1. Выделение ДНК
3.1.7.2. Выделение РНК
3.1.8. Амплификация ВИЧ-специфичных фрагментов нуклеиновых кислот
3.1.8.1. Полимеразная цепная реакция с внешними праймерами
3.1.8.2. Полимеразная цепная реакция с внутренними праймерами
3.1.9. Анализ нуклеиновых кислот
3.1.9.1. Электрофорез препаратов ДНК

3.1.9.2. Перенос и иммобилизация ДНК на фильтрах
3.1.9.3. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот
3.1.10. Клонирование и анализ амплифицированных ВИЧ-специфичных фрагментов
3.1.10.1. Подготовка плазмидного вектора для клонирования
3.1.10.2. Подготовка амплифицированного фрагмента для клонирования
3.1.10.3. Лигирование
3.1.10.4. Подготовка компетентных клеток Е. соИ для трансформации
3.1.10.5. Трансформация клеток Е.соН рекомбинантными плазмидами
3.1.10.6. Отбор рекомбинантных клонов
3.1.10.7. Анализ клонированных фрагментов
3.1.11. Секвенирование клонированных ВИЧ-специфичных фрагментов
3.1.12. Анализ первичных последовательностей ВИЧ-специфичных фрагментов
3.1.13. Молекулярно-филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей провируса ВИЧ
3.2. Результаты
3.2.1. Создание системы лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции и внедрение методов подтверждающей диагностики в Ленинграде/С.-Петербурге
3.2.2. Изучение качества тестирования на ВИЧ
в лабораториях С.-Петербурга и России
3.2.3. Выявление первых случаев ВИЧ-инфекции в Ленинграде и описание ранней
фазы эпидемии ВИЧ-инфекции в Ленинграде/Санкт-Петербурге
3.2.4. Серотипирование ВИЧ
3.2.4.1. Серотипирование сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов
с известным генотипом ВИЧ
3.2.4.2. Исследование иммунореактивности сывороток отдельных ВИЧ-инфицированных пациентов на разных сроках ВИЧ-инфекции
3.2.4.3. Серотипирование ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге
3.2.4.4. Серотипирование ВИЧ-1 в Москве
3.2.4.5. Серотипирование ВИЧ-1 на Украине
3.2.5. Вирусологические исследования

Представления о двух основных фенотипах ВИЧ сформировались до выяснения молекулярного механизма избирательного тропизма разных изолятов ВИЧ по отношению к лимфоцитом и макрофагам, который стал понятен после выяснения той роли, которую играют в проникновении ВИЧ в клетку рецепторы к хемокинам. С учетом значения рецепторов к хе-мокинам для биологии ВИЧ было проведено исследование [59], в котором 36 первичных изолятов различных субтипов ВИЧ-1 проверялись на способность инфицировать клетки глиомы, трансгенные по разным хемокиновым рецепторам: CCR1 — CCR5 и CXCR2. NSI-изоляты оказались способными инфицировать только клетки, содержащие CCR5 рецепторы. SI-изоляты могли пользоваться рецепторами типа CCR2b, CCR3, CCR5 и CXCR2. Более того, 2 из SI-изолятов могли инфицировать клетки, не имеющие известных рецепторов к хемокинам. Расширение спектра используемых рецепторов к хемокинам было найдено и при исследовании изолятов, последовательно получаемых у ВИЧ-инфицированных пациентов по мере прогрессии инфекции [89].
Выяснение роли рецепторов к хемокинам в патогенезе ВИЧ-инфекции позволило предложить новую фенотипическую классификацию ВИЧ-1, основанную на способности вируса взаимодействовать с теми или иными рецепторами или их комбинациями [57]. Она имеет все шансы заменить собой ныне принятые способы классификации, но, поскольку этого еще не произошло, в дальнейшем здесь будут употребляться старые термины: «макрофаготропные и Т-лимоцитотропные вирусы» или «вирусы, образующие (SI) или не образующие (NSI) синцитии».
2.3.3. Вариабельность ВИЧ
2.2.3.1. Мутационная изменчивость генома ВИЧ
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей и рестрикционных карт ряда изолятов ВИЧ-1 показал, что ВИЧ-1 отличается от других вирусов высокой степенью генетической вариабельности [150, 151, 340]. Скорость эволюции гена env составляет (3,2— 15,8)-1(Г3 нуклеотидных замен в год, а гена gag — (3,7-18,5)Т(Г3 нуклеотидных замен в год [151]. Основная часть замен в гене env носит характер толковых мутаций. Все изменения сосредоточены в нескольких гипервариабельных областях этого гена. Частота нуклеотидных замен в различных кодирующих областях генома ВИЧ-1 различна. Так, частота молчащих