Изучение регуляторной функции С-концевого сегмента рековерина

• Автор: Колпакова, Татьяна Валерьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Роль кальциевых сигналов в нейронах
2. Общая характеристика нейрональных Са2+-связывающих белков
3. Кальмодулин
4. Нейрональные кальциевые сенсоры (НКС)
4Л. Тканевая и клеточная локализация НКС
4.2. Первичная структура и посттрансляционное модифицирование НКС
4.3. Са2+-связывающие центры НКС
4.4. Пространственная структура НКС
4.4.1. Структура бескальциевых форм НКС
4.4.2. Механизм Са2+-миристоильного переключателя НКС
4.4.3. Структура Са2+-связанных форм НКС
4.5. Особенности функционирования НКС
4.5.1. Чувствительность НКС к Ca2+иMg2+
4.5.2. Взаимодействие НКС с мембранами и их внутриклеточная локализация
4.5.3. НКС: участие во внутриклеточных процессах и белки-мишени
4.5.4. Структурные аспекты взаимодействия НКС с их мишенями
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение С-концевых делеционных мутантов рековерина
2. Исследование термостабильности С-концевых делеционных мутантов рековерина
3. Исследование Са2+-зависимых свойств С-концевых делеционных мутантов рековерина
4. Исследование способности С-концевых делеционных мутантов рековерина взаимодействовать с родопсинкиназой
5. Исследование способности С-концевых делеционных мутантов рековерина ингибировать активность родопсинкиназы

6. Исследование способности С-концевых делеционных мутантов рековерина экспонировать гидрофобный карман
7. Химерный белок рековерина и GCAP2: получение, термостабильность и способность ингибировать родопсинкиназу
8. Молекулярное моделирование комплекса рековерина с N-концевым доменом родопсинкиназы
9. С-концевые точечные мутанты рековерина: получение и функциональные свойства
10. Регуляция функционирования рековерина и других ИКС с участием С-
концевого сегмента: возможные механизмы
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы и реактивы
2. Получение мутантов рековерина и Ы-коицевого домена родопсинкиназы
2.1. Получение генетических конструкций, кодирующих мутанты рековерина и N-концевого домена родопсинкиназы
2.2. Экспрессия генов рековерина дикого типа и его мутантных форм, выделение и очистка рекомбинантных белков
2.3. Определение содержания примеси немиристоилированной формы в препаратах рековерина дикого типа и его мутантных форм
2.4. Экспрессия генов GST, GST-N-RK и GST-N-RKF3A, очистка и выделение рекомбинантных белков
2.5. Экспрессия гена GCAP2, выделение и очистка рекомбинантного белка
3. Определение температурных зависимостей параметров собственной флуоресценции рековерина дикого типа и его мутантных форм
4. Определение количества кальция, связанного с рековерином дикого типа и его мутантными формами
5. Связывание рековерина дикого типа и его мутантных форм с
фоторецепторными мембранами
5.1. Выделение наружных сегментов палочек сетчатки

5.2. Получение отмытых мочевиной фоторецепторных мембран
5.3. Приготовление кальциевых буферов
5.4. Связывание различных форм рековерина с отмытыми мочевиной
фоторецепторными мембранами
6. Связывание рековерина дикого типа и его мутантных форм с 08Т-Ы-Е.К и С8Т-№-ЯКрза
6.1. Аффинное соосаждение рековерина дикого типа и его мутантных форм с ОЗТ-И-МС
6.2. Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса
6.2.1 Иммобилизация СвТ-Ы-КК и С8Т-Ы-ККН,Д на поверхности сенсорного чипа
6.2.2. Определение констант диссоциации комплексов рековерина дикого типа и его мутантных форм с 08Т-18Г-КК и 08Т-М-ЫКРЗА
8. Ингибирование родопсинкиназы под действием рековерина дикого типа и его мутантных форм
8.1. Очистка родопсинкиназы из НСП
8.2. Измерение активности родопсинкиназы в присутствии рековерина дикого типа или его мутантных форм
9. Взаимодействие рековерина дикого типа и его мутантных форм с фенилсефарозой
10. Молекулярное моделирование комплексов рековерина дикого типа или его мутантных форм с М-концсвым 16-звенным пептидом родопсинкиназы
11. Аналитические процедуры
11.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле
11.2. Электрофорез в ПААГ
11.3. Иммуноблоттинг
11.4. Определение концентрации белков
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

шпильки на М-конце белка (образована аминокислотными остатками 02 и ЭЗ), при этом миристоильный остаток поворачивается на 180° и ориентируется параллельно а-спирали А [84].
Помимо рековерина механизм Са2+-миристоильного переключателя реализуется у визининоподобных белков и N08-1 [23, 85, 94, 95, 96, 103]. Однако, ни для одного из этих белков структурные перестройки, приводящие к экспонированию миристоильной группы, подробно не описаны, прежде всего из-за отсутствия данных о структурной организации соответствующих бескальциевых форм большинства из этих белков. Считается, что как и в случае рековерина, связывание Са2+ с этими белками вызывает конформационные повороты вокруг двух консервативных остатков глицина, один из которых располагается в междоменном линкере (095 у N08-1 и визининоподобных белков), а второй - в Са2+-связывающей петле нефункционального ЕР1 (041 у N08-1 и визининоподобных белков). Отме-

тим, что у всех НКС, в которых реализуется механизм Са -миристоильного переключателя, присутствие миристоильной группы обусловливает возникновение междоменной кооперативности по связыванию кальция (т.е. кооперативности между Са2+-связывающими центрами, расположенными в разных доменах этих белков). Кроме этого, присутствие миристоильной группы понижает общее сродство НКС к ионам кальция, поскольку связывание катиона становится конформационно связанным с ее экспонированием в раствор, которое является энергетически невыгодным [23, 103]. Так, неацилированный рекомбинантный рековерин некооперативно связывает два иона кальция с Кс, равными 0,11 и 6,9 мкМ, тогда как ацилированная форма связывает лиганд с Ко, равной 17,4 мкМ, и коэффициентом Хилла, равным 1,75, что говорит о положительной кооперативности связывания Са2+ в последнем случае [25].
В белках НКС, относящихся к группам вСАР и КСЫР, механизм Са2+-миристоильного переключателя не реализуется. В случае ОСАР! в