Дизайн и синтез двойного обращенного рибозима для сайт-направленного изменения последовательности РНК

• Автор: Иванов, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 с. : ил.

Список сокращений

I. Влияние структуры шпилечных рибозимов на их каталитическую 9 активность в реакциях расщепления и лигирования РНК

(обзор литературы)

1.1 Строение и свойства шпилечных рибозимов

1.1.1 Минимальный шпилечный рибозим

1.1.1.1 Происхождение минимального шпилечного рибозима

1.1.1.2 Первичная, вторичная и третичная структура минимального 13 шпилечного рибозима

1.1.1.3 Сворачивание рибозим-субстратного комплекса

1.1.1.4 Каталитический механизм действия шпилечных рибозимов

1.1.2 Обращенный шпилечный рибозим, его происхождение и свойства

1.2 Шпилечные рибозимы в реакциях расщепления и лигирования РНК

1.2.1 Природные рибозимы
1.2.1.1 Кинетика и термодинамика реакций расщепления и 36 лигирования РНК
1.2.1.2 Влияние стабильности и структуры рибозим-субстратного 41 комплекса на активность рибозима
1.2.2 Искусственные рибозимы
1.2.2.1 Вилочный шпилечный рибозим
1.2.2.2 Обращенный шпилечный рибозим
II. Дизайн и синтез двойного обращенного рибозима 53 для сайт-направленного изменения последовательности РНК
(результаты и их обсуждение)
11.1 Дизайн двойного рибозима
как инструмента молекулярного воздействия

11.1.1 Стратегия сайт-направленного изменения последовательности РНК
11.1.2 Двойной рибозим R-DRBV
И.1.2.1 Предполагаемый способ синтеза рибозима R-DRBV
11.1.2.2 Синтез РНК посредством удлинения праймера при помощи РНК-полимеразы фага Т7
И. 1.2.3 Разветвленный рибозим R-RB
11.1.2.3.1 Строение рибозима R-RB
11.1.2.3.2 Химический синтез рибозима R-RB
11.1.2.3.3 Каталитические свойства рибозима R-RB
И.2 Оптимизация структуры обычного обращенного рибозима в реакциях расщепления и лигирования РНК
11.2.1 Влияние природы нуклеотида
в месте соединения доменов рибозима на его активность
11.2.2 Влияние длины полинуклеотидного линкера на активность рибозима
0 II.3 Двойной обращенный рибозим R-DRV
в реакции сайт-направленного изменения последовательности РНК
11.3.1 Модельная реакция изменения последовательности субстрата S40F3F5
11.3.2 Синтез двойного рибозима R-DRV
11.3.3 Свойства рибозима R-DRV в реакции расщепления РНК
11.3.4 Изменение последовательности РНК при помощи рибозима R-DRV
11.3.5 Оптимизация условий
реакции изменения последовательности РНК
11.3.6 Каталитическая активность рибозима R-DRV
П.3.7 Внутреннее мечение РНК остатком молекулы-красителя Су5
III. Экспериментальная часть
111.1 Реактивы и материалы
111.1.1 Реагенты и растворители
111.1.2 Ферменты

111.1.3 Буферные растворы
111.1.4 Разделяющие материалы
111.1.5 Приборы
III.2 Методы и методики
111.2.1 Физико-химические методы анализа
111.2.1.1 Анализ РНК при помощи A.L.F. секвенатора ДНК
111.2.1.2 Анализ РНК при помощи LiCor4200 секвенатора ДНК
111.2.1.3 Методы при получении РНК и ДНК
111.2.2 Синтезы
111.2.2.1 Синтез амидофосфита Ы4-(6-гидроксигексил-0-левулинил)-5-метил-5'-0-(4,4’-диметокситрифенил-метил)-1 -p-D-2-дезоксицитидина (8)
111.2.2.2 Синтез субстратных РНК
111.2.2.3 Мечение субстратных РНК
111.2.2.4 Синтез разветвленного рибозима R-RB
111.2.2.5 Синтез немодифицированных рибозимов
111.2.2.6 Синтез РНК-фрагментов,
содержащих 2',3'-циклическую фосфатную группу
III.2.3 Определение нуклеотидного состава рибозима И-НВ
III.2.4 Получение РНК посредством удлинения праймера при помощи РНК-полимеразь| фага Т7
III.2.5 Расщепление РНК-субстратов
III.2.6 Лигирование РНК-фрагментов
III.2.7 Изменение последовательности РНК
III.2.8 УФ плавление дуплексов
III.2.9 Определение периода полураспада 2’,3'-циклической фосфатной группы в составе РНК
Выводы
Список литературы

линкера, во-первых, препятствует повышенному движению обеих цепей рибозим-субстратного комплекса относительно друг друга, делая его структуру более жесткой. Во-вторых, наличие линкера необходимо, чтобы обеспечить пространственную близость петель А и В комплекса и, следовательно, сохранить каталитическую активность рибозима.
Увеличение длины линкера повышает гибкость цепи рибозима в месте соединения его доменов, в результате чего сворачивание рибозим-субстратного комплекса в правильную пространственную структуру становится более легким. Действительно, положительное влияние гибкости структуры комплекса в месте соединения субстрат-связывающего и каталитического доменов рибозима на процесс сворачивания наблюдали также для крестообразного и вилочного шпилечных рибозимов [29, 42, 106]. Отсутствие каталитической активности у обращенного рибозима, не содержащего линкер, может быть обусловлено отсутствием или неблагоприятным пространственным перекрыванием петель А и В. Также вероятно, что отсутствие «шарнира» между цепями комплекса приводит к возникновению коаксиального стекинга между участками Н1 и Н4. Например, его наличие между участками Н2 и НЗ в минимальном рибозиме отрицательно влияет на сворачивание комплекса и активность рибозима [63]. Для гексацитидилатного линкера было показано, что замещение в нем остатков цитидина на остатки аденозина приводит к увеличению константы скорости реакции расщепления в 1,5 раза. Объяснение этому эффекту найдено не было.
В настоящем литературном обзоре было продемонстрировано, что шпилечные рибозимы, несмотря на их общность с другими видами природных РНК-катализаторов, обладают некоторыми особенностями строения и функционирования. Подобно рибозимам вида «головка молотка» или вируса гепатита дельта, шпилечные рибозимы катализируют реакцию сайт-направленного расщепления последовательности РНК-субстрата и обратный ей процесс соединения двух РНК-фрагментов - лигирование. После расщепления цепи РНК образуются два продукта. Один из них содержит 5'-концевую ОН-группу, а другой - 2’,3’-циклическую фосфатную группу. Лигирование протекает в обратном направлении и приводит к образованию только 5’,3’-межнуклеотидной фосфодиэфирной связи. Реакция трансэтерификации подчиняется механизму бимолекулярного нуклеофильного замещения (Дд; 2) и происходит в активном центре рибозим-субстратного комплекса. Комплекс состоит из двух цепей, одна из которых образована субстрат-связывающим доменом рибозима и субстратной