Рекомбинантные полипептиды для терапии глазных заболеваний, сопровождающихся патологическим ангиогенезом

• Автор: Бейрахова, Ксения Андреевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

Оглавление
Введение
Г лава 1. Препараты на основе эндогенных ингибиторов ангиогенеза как альтернатива анти-УЕСй-направленной терапии неоваскулярных глазных заболеваний
1.1 Основные этапы развития ангиогенеза
1.2. AHTH-VEGF-направленная терапия
1.2.1. VEGF как терапевтическая мишень
1.2.2. Офтальмологические препараты, блокирующие действие VEGF
1.2.3. Ограничения и побочные эффекты при терапии блокаторами VEGF
1.3. Эндогенные ингибиторы ангиогенеза и их терапевтический потенциал в офтальмологии
1.3.1. Тромбоспондин
1.3.2. Фактор дифференцировки пигментного эпителия (Pigment epithelium-derived factor, PEDF)
1.3.3. Фрагменты коллагена ГУ — аррестен, канстатин, тумстатин
1.3.4. Фрагмент коллагена XVIII — эндостатин
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы
2.2. Ферменты
2.3. Штаммы и клеточные линии
2.4. Плазмидные вектора
2.5. Лабораторное оборудование
2.6. Растворы
2.7. Методы
Глава 3. Получение и свойства рекомбинантных полипептидных
препаратов на основе эндогенных ингибиторов ангиогенеза
3.1 Получение рекомбинантного фрагмента тумстатина (L69K-95)

3.2. Получение рекомбинантного фрагмента PEDF (44-77)
3.3. Получение рекомбинантного фрагмента эндостатина (1-49)
3.4. Оценка биологической активности рекомбинантных антиангиогенных пептидов in vitro
3.5. Биологическая активность рекомбинантных антиангиогенных пептидов in vivo
3.5.1. Оценка антиангиогенной активности пептидов на модели неоваскуляризации роговицы кролика
3.5.2. Оценка аваскулогенной активности пептидов на модели щелочного ожога роговицы
Выводы
Список литературы

Перечень сокращений
ВМД — возрастная макулярная дегенерация
ГБ — гибридный белок
ДМСО — диметилсульфоксид
ДР — диабетическая ретинопатия
ДТТ — дитиотреитол
ИК50 — ингибирующая концентрация
ИПТГ — изопропил-(3-В-1-тиогалактопиранозид
ОФ ВЭЖХ — обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография
ПААГ — полиакриламидный гель
ПЭГ — полиэтиленгликоль
ТПС — трубочко-подобные структуры
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭК — эндотелиальные клетки
CBD — хитинсвязывающий домен
СОХ-2 — циклооксигеназа
ED50 — эффективная доза
ESI — ионизация распылением в электрическом поле
bFGF — основной фактор роста фибробластов
HIF — фактор, индуцируемый гипоксией
ММР — матриксная металлопротеиназа
NC1 — неколлагеновый домен
PDGF — тромбоцитарный фактор роста
PEDF — фактор дифференцировки пигментного эпителия
PMSF — фенилметилсульфонилфторид
SDS — додецилсульфат натрия
TFA — трифторуксусная кислота
TOF — времяпролётный масс-спектрометрический детектор
TSP-1 — тромбоспондин
VEGF — сосудистый эндотелиальный фактор роста

mP1: HTHQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR mP1-H1/3A: ATAQDFQPVLHLVALNTPLSGGMRGIR

mP1-H1/3A
Рисунок 15. Схематическое изображение фрагмента 1-27 .мышиного эндостатина (mPl). Замена остатков His 1 и His3 на остатки аланина приводит к неспособности связывания пептида с ионом цинка [173].
В работах [176] и [177] был выявлен ещё один фрагмент эндостатина, обладающий антиангиогенными свойствами, - богатый аргинином мотив R62-R63-A64-D65-R66-A67. При анализе кристаллической структуры полноразмерного эндостатина было выявлено, что сходный мотив образуется в результате сближенного расположения остатков R27-G28-A29-D30 и R47-А48. Исследование фрагмента эндостатина 6-49 методом молекулярной динамики показало, что при фолдинге этого фрагмента сохраняется кластер R27-G28-A29-D30-R47-A48, что, по-видимому, и определяет антиангиогенные свойства этого пептида [178] (Рисунок 16).
Рисунок 16. Фрагмент эндостатина (6-49) в начале (слева) и в конце 30-наносекундной симуляции молекулярной динамики. Основные структурные изменения претерпевает Ы-концевая часть пептида (показана стрелкой), в то время как расположение остатков кластера К27-(128-А29-[Э30-Р47-А48 остаётся стабильным на протяжении всей симуляции [178].