Структурно-функциональное изучение гомологичных фрагментов факторов дифференцировки PEDF и HLDF

• Автор: Жохов, Сергей Сергеевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 142 с. : ил.

1. Идентификация фактора РЕОЕ в различных типах клеток

1.1. Идентификация РЕОЕ в культуральной среде клеток пигментного эпителия

сетчатки глаза человека

1.2. Идентификация РЕОЕ ЕРС1 в культуре легочных фибробластов.

Зависимость уровня экспрессии РЕОЕ от возраста клеточной культуры.

1.3. Идентификация РЕОЕ мыши каспина коллагенсвязывающего

серпина

2. Особенности структуры РЕОЕ и кодирующего его гена.

2.1. Установление первичной структу ры РЕОЕ человека и его кДНК

2.2. рииадлежность РЕОЕ к семейству нсингибиторных ссрпинов

2.3. Наличие в РЕОБ связи, высокочувствительной к действию ссриновых

протеи наз
2.4. Асимметричное расположение положительных и отрицательных зарядов в
молекуле РЕ1Ж Кристаллическая структура РЕОЕ
2.5. Строение и свойства генареИчеловека
2.6. Распространенность и эволюционная консервативность фактора РЕОЕ.
2.7. Рекомбинантный РЕПЕ.
3. Дифференцирующее действие РЕОЕ и его влияние на метаболизм
3.1. Дифференцирующее действие РЕОЕ на эмбриональные ткани. Влияние
РЕОЕ на метаболизм глиальных клеток.
3.2. Дифференцирующее действие РЕОЕ на опухолевые клетки.
3.3. Влияние РЕОЕ на накопление меланина и активность тирозипазы в клетках
пигментного эпителия сетчатки глаза.
4. Нейропротекторное действие
4.1. Протекторное действие РЕОЕ на нейроны сетчатки глаза
4.2. Протекторное действие РЕОЕ на гранулярные клетки мозжечка крыс.
4.3. Протекторное действие . на нейроны гиппокампа
4.4. Протекторное действие РЕОЕ на двигательные нейроны спинного мозга.
5. Антиангиогенное действие
5.1. Корреляция уровня РЕОР и УЕОЕ с ангиогенезом в сетчатке. Влияние содержания кислорода в окружающей среде на экспрессию РЕОЕ.
5.2. Изменения уровня РЕОР при зрительных патологиях, связанных с избыточным ангиогенезом
5.3. Возможные механизмы антиангиогенного действия РРОЕ
6. Взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами РЕОР. Идентификация рецептора РЕОР.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Идентификация гомологичных фрагментов молекул факторов ПЬОР и РЕОЕ, отвечающих за их дифференцирующее действие на клетки НЬ и эктодерму эмбрионов Хепориз аеш на стадии ранней гаструлы.
1.1. Структурная гомология фрагментов молекул факторов . и РЕОК. Сравнительное изучение дифференцирующего действия факторов Н.ОЕ и РЕОГ на клетки линии НЬ.
1.2. Сравнительное изучение индукционного действия факторов НЬОЕ и РЕОЕ, а также пептидов НЬОЕ6 и РЕОб на эктодерму эмбрионов X. 1аеЬ
2. Сравнительное изучение протекторного действия пептидов НЬОЕб и РЕОЕ6 на нейроны червя мозжечка крыс и клетки линии НЬ при индуцированной химической гипоксии.
2.1. Протекторное действие пептидов на клетки червя мозжечка крыс. Восстановление под действием пептидов поведенческих реакций, нарушаемых при химической гипоксии червя мозжечка
2.2. Влияние пептидов НОЕ6 и РР.ОЕ6 на выживаемость клеток линии Н. при индуцируемой химической гипоксии.
3. Изучение молекулярных механизмов действия пептидов Н1.ПН6 и РЕОК6 на клетки линии НЬ.
3.1. Определение характера взаимодействия пептидов с клетками. Влияние пептидов на подвижность липидов в мембранных системах.
3.2. Влияние пептидов НЫГ6 и РЕОЕ6 на активность аденилатпиклазы в клетках линии НЬ и выделенных клеточных мембранах
3.3. Влияние пептидов НЫЖ6 и РЕОБб на активность фосфатидилинозитолспецифичсской фосфолипазы С.
4. Компьютерное моделирование пространственной структуры РЕЖ Регуляторная роль протеолиза связи 2Ь3Т в молекуле РЕПЕ
5. Роль фактора РЕОЬ в индукционном действии стекловидного тела глаза быка на эктодерму эмбрионов Хепорт 1аЫэ.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Материалы.
1.1. Реактивы
1.2. Сорбенты
1.3. Протеолитические ферменты.
1.4. Факторы дифференцировки, антитела, клеточные линии
1.5. Буферные растворы.
1.6. Растворы для индукции дифференцировки эмбрионов Хепорт 1ает и
гистологической обработки тканей
2. Методы.
2.1. Культивирование клеток линии НЬ.
2.2. Определение дифференцирующей активности
2.3. Исчерпывающий гидролиз белков смесью трипсина и ахнмотрипенна
2.4. Синтез пептидов
2.5. Дополнительная хроматографическая очистка синтезированных
пептидов.
2.6. Индукция дифференцировки эктодермы эмбрионов Хепорт 1аеУ на стадии
ранней гаструлы
2.7. Гистологическая обработка дифференцированной эктодермы Хепорт
2.8. Содержание экспериментальных животных
2.9. Изучение влияния пептидов на поведенческие реакции крыс, зависимые от функций червя мозжечка
2 Определение количества гиперхромных клеток Пуркинье червя мозжечка крыс
2 Определение количества жизнеспособных клеток НЬ методом МТТтесга.
2 Радиолигандный анализ.
2 Получение липосом, содержащих флуоресцентный зонд.
2 Изучение влияния пептидов на анизотропию поляризации флуоресценции зонда в лилосомах.
2 Хроническая морфинизация клеток НЬ.
2 Выделение и солюбилизация мембран клеток НЬ
2 Изучение влияния пептидов на активность аденилатциклазы в клетках НЬ и препарате выделенных мембран клеток НЬ.
2 Определение количества цАМФ в пробах
2 Определение внутриклеточной концентрации инозитолмоно и дифосфатов в клетках линии Н1
2 Выделение стекловидного тела глаза быка.
2 Измерение концентрации белка методом Бредфорд.
2 Определение Мконцсвых аминокислотных последовательностей.
2 ЯОЯэлекгрофорез белков в полиакриламидном геле.
2 Компьютерное моделирование пространственной структуры молекулы РЕПЕ
2 Статистическая обработка экспериментальных результатов
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Идентификация в культу ральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза человека. Впервые был обнаружен в году группой американских исследователей под руководством . V. в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза, выделенных из плода человека 1,2. К числу основных функций ПЭ относится создание барьера между фоторецепторами и кровеносным руслом, поддержание определенного состава среды, окружающей фоторецепторы, фагоцитоз наружных сегментов фоторецепторов и метаболизм витамина А . Клетки ПЭ секретируют ростовые факторы, необходимые для развития и функционирования сетчатки, которые действуют на последнюю через интерфоторецепторный матрикс ИФМ довольно узкое внеклеточное пространство между ПЭ и слоем фоторецепторов . При изучении действия культуральной среды клеток ПЭ человеческих эмбрионов на клетки ретинобластомы линии было обнаружено, что среда вызывает остановку неограниченного роста и деления этих клеток. При этом более клеток приобретают морфологические и биохимические характеристики зрелых нейронов 1. Культуральную среду ПЭ фракционировали методом препаративного электрофореза в полиакриламидном геле, затем с помощью хроматографических методов из нее выделили один белок с молекулярным весом около кДа. Он получил название iiiiv фактор, выделенный из пигментного эпителия. Как было позднее установлено, . Выделенный действует на клетки в минимальной концентрации нгмл среды. Эффект препарата проявляется значительно быстрее, в случае чем культуральной среды ПЭ. Вероятно, последняя содержит какиелибо ингибиторы или ферменты деградации 2. На клетках линии было испытано действие ряда других хорошо охарактеризованных факторов роста и диффсренцировки v , , i , и i i . Ни один из них не вызывал диффсренцировки клеток в зрелые нейроны, подобно . Была изучена морфология образований, возникающих при дифференцировке клеток под действием выделенного препарата . Через часа после переноса стимулированной культуры на подложку клетки образовывали отростки, которыми тесно взаимодействовали друг с другом. Через суток формировались коронообразные клеточные агрегаты, представляющие собой замкнутое кольцо с пустым пространством в центре, отростки клеток направлены преимущественно наружу кольца. Авторы отмечают, что именно такая морфология характерна для развивающейся нервной, в том числе и сетчаточной ткани в эмбрионе. То есть под воздействием идет не просто трансформация отдельных клеток, но и их кооперативное взаимодействие, приводящее к формированию зрелой сетчаточной ткани 9. Действие на сетчатку, как и в случае других факторов, секретируемых ПЭ, происходит через ИФМ, в котором присутствует в растворимом виде в концентрации около 0 нМ 1. Препарат, полученный при смыве содержимого ИФМ глаза быка, оказывает на клетки действие, подобное , однако при действии агрегаты клеток отличаются большей степенью морфологической организации . Идентификация ЕРС1 в культуре легочных фибропластов. Зависимость уровня экспрессии от возраста клеточной культуры. Независимо от i и др. ПЭ 1,2,9, этот фактор был идентифицирован группой ученых под руководством . I. Эти клетки сохраняют способность к делению ограниченное число циклов, с каждым последующим циклом возрастает продолжительность фазы . В конечном итоге они полностью утрачивают способность к синтезу ДНК, переходя в состояние репликативного старения . При перенесении клеток I в среду без сыворотки они входят в состояние ростового запрета фазу покоя . В клетках, прошедших менее репликативных циклов, введенных в фазу 0, уровень экспрессии одной из мРПК размером 1,4 тыс. Соответствующую кДНК авторы назвали ЕРС1 iiv кДНК, специфическая для клеточных популяций ранних генераций. При се сравнении с данными со структурами уже имеющихся генов в геномной библиотеке оказалось, что она полностью идентична кДНК . Аминокислотные последовательности и белка, транслируемого с мРНК ЕРС1, также оказались идентичными . На стадии экспоненциального роста клеток экспрессия мРНК ЕРС1 значительно ниже, чем в фазе , и практически не зависит от возраста культуры.