Изучение функциональной роли метилирования G966/C967 16S PPHK Escherichia coli

• Автор: Прохорова, Ирина Валерьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Список сокращений
Обзор литературы
Регуляция трансляции на стадии инициации
Роль фактора IF3 в регуляции инициации трансляции
Регуляция инициации: «арест» 30S пре-инициаторного комплекса:
Регуляция инициации: «сопряженная» трансляция
Регуляция инициации на стадии образования 30S пре-инициаторного комплекса:
«конкуренция» за мРНК
Регуляция трансляции спектиномицинового оперона
Регуляция трансляции стрептомицинового оперона
Регуляция трансляции rplKAJL-rpoBC оперона
Регуляция трансляции белка S1
Регуляция трансляции белков бактериофагов
Адаптация бактерий к различным условиям посредством регуляции трансляции
РНК-термосенсоры: адаптация к холодовому шоку на стадии инициации трансляции.

РНК-термосенсоры: адаптация к тепловому шоку на стадии инициации трансляции.

Регуляция трансляции малыми некодирующими РНК
Регуляция системы токсин-антитоксин с помощью мнкРНК
Роль мнкРНК в активации различных метаболических путей и адаптации бактерий к
стрессовым условиям
Роль мнкРНК в регуляции экспрессии факторов вирулентности бактерий и передаче
межклеточных сигналов («quorum sensing»)
Взаимодействие рибосомы с РНК-полимеразой, аттенюация и анти терминация
транскрипции
Регуляция экспрессии S10 оперона, антитерминация транскрипции
Регуляция экспрессии белков биосинтеза аминокислот: аттенюация транскрипции. .46 Механизмы регуляции, основанные на остановке трансляции при связывании с
рибосомой низкомолекулярных кофакторов
Регуляция трансляции РНК рибопереключателями
Роль метилирования в регуляции трансляции
Роль метилирования 16S рРНК в регуляции трансляции на стадии инициации
Диметилирование остатков А1518, А1519 16S рРНК
Роль метилирования в поддержании структуры элементов рРНК: метилирование по
2’-ОН группе
Роль метилирования тРНК в поддержании рамки считывания
Метилирование как вторичная функция рРНК метилтрансфераз
Роль метилирования G966/C967 в 16S рРНК
Обсуждение результатов
Постановка задачи
Характеристика фенотипа мутантного штамма ArsmB/ ArsmD
Анализ холодочувствительного фенотипа штамма ArsmBIArsmD
Влияние метилирования G966/C967 на белковый состав клетки
Влияние метилирования G966/C967 на регуляцию триптофанового оперона E.coli
Определение аффинности fMct-TPHKfMet к P-участку 30S субчастиц дикого и
мутантного типов
Влияние метилирования G966/C967 на образование 30S инициаторных комплексов. ...84 Изучение образования 30S инициаторных комплексов с 30S субчастицами дикого и мутантного типов с помощью методов быстрой кинетики
Влияние метилирования G966/C967 на эффективность образования 70S IC in vitro
Эффективность инициации трансляции в штаммах дикого и мутантного типа in vivo
Материалы и методы
Реактивы
Буферы и растворы
Конструирование штамма с двойной делецией генов rsmBlrsmD
Сравнение протеом штаммов дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD
Идентификация белковых зон при помощи МАЛДИ масс спектрометрическим анализа.

Измерение точности инициации трансляции с помощью репортерных конструкций in
vivo
Создание плазмид pAra2AUG, pAra2GUG, pAra2UUG, pAra2CUG, pAra2AUU, pAra2TrpL, pAra2TrpL-trpE, pAra2TrpLtrpE2A несущих гены репортеров Flue, Rluc. 99 Трансформация штаммов дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD репортерными
конструкциями и измерение активности белков репортеров Flue, Rluc
Измерение количеств мРНК белков Flue, Rluc, экспрессированных в штаммах дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD, несущих плазмиды pAra2TrpL и pAra2TrpL-trpE,
методом RT-qPCR
Выделение суммарной РНК и проведение обратной транскрипции
Проведение количественного ПЦР анализа в реальном времени
Исследование рибосомных профилей из клеток дикого типа и мутантного
ArsmB/ArsmD, выращенных при 37°С и 18°С
Выделение рибосом из штаммов дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD
Получение препаратов мРНК
Детекция образования 70SIC, 30SIC и комплексов f[3H]Met-TPHKfMet с 30S
субчастицами при связывании на нироцеллюлозных фильтрах
Определение эффективности образования 30SIC методом RelE-принтинга
Анализ модификации рРНК с помощью реакции обратной транскрипции
Исследование этапов образования 30SIC методом «stopped flow»
Выводы
Список литературы

Список сокращений
мРНК - матричная РНК
тРНК - транспортная РНК
IF1, IF2, IF3 - факторы инициации 1,2, З
EF-Tu - фактор элогации Tu
EF-G - фактор элонгации G
RF1, RF2, RF3 - факторы терминации 1, 2, З
RRF - фактор рециклирования
elFl - фактор инициации 1 эукариот
RNAP, ОгРР’ - РНК-полимераза
РСА - рентгено-структурный анализ
н. — нуклеотиды
GTP - гуанозинтрифосфат
Pre-30S 1C - 30S пре-инициаторный комплекс
30S 1C - 30S инициаторный комплекс
70S 1C- 70S инициаторный комплекс
SAM - S-аденозилметионин
«stopped flow» - метод остановленного потока
RT-qPCR - обратная транскрипции с последующим количественным ГТЦР анализом ИЭФ - изоэлектрофокусировка
МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация 5’-UTR - 5’-нетранслируемая область мРНК З’-UTR - З’-нетранслируемая область мРНК Kd - константа диссоциации
FRET - резонансный перенос энергии флуоресценции

Дальгармо во втором модулируется мультимерным белком TRAP. Для активации TRAP должен быть связан с молекулой триптофана. Участок связывания TRAP состоит из 9-11 повторов (GAJ)AG, разделенных несколькими нуклеотидами. Такие участки обнаружены в 5’-коицевой области trpEDCFBA, trpG и yhaG мРНК. При взаимодействии с мРНК 11 субъединиц белка, активированных триптофаном, образуют кольцо, вокруг которого делает виток мРНК (Рис. 35). Это приводит к термипации транскрипции в начале транскрипта trpEDCFBA и подавлению инициации трансляции trpEDCFBA, trpG и yhaG мРНК.
Рис. 35. Регуляция инициации трансляции нрЕйСРВА мРНК посредством связывания ТЯЛР. Выделены (0/и)А0 повторы, взаимодействующие с белком, подчеркнуты последовательность Шайн-Дальгарно и инициаторный кодон, участок мРНК, взаимодействующий с участком посадки рибосомы, выделен черным [88].
Механизмы регуляции, основанные на остановке трансляции при связывании с рибосомой низкомолекулярных кофакторов.
Связывание низкомолекулярных кофакторов с рибосомой может приводить к остановке трансляции. По такому механизму работают антибиотики, действующие на рибосому. Они связываются в определенном участке рибосомы и нарушают ключевые стадии белкового синтеза: пептидилтрансферазную реакцию, отбор аминоацилированных тРНК в А-участкс, транслокацию тРНК. Их действие, как правило, распространяется на трансляцию всех мРНК. В литературе известны примеры, когда остановка рибосомы при связывании низкомолекулярного кофактора происходит при трансляции определенной мРНК и играет регуляторную роль. К ним относятся связывание свободного триптофана при трансляции лидерного пептида таС, связывание эритромицина при трансляции лидериого пептида еппСЬ, индукция хлорамфениколом экспрессии белков, придающих устойчивость к хлорамфениколу. и связывание тетрациклина, регулирующего экспрессию белков 1е1 семейства. Рассмотрим их более подробно.