Функции теломеразного белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae Est3

• Автор: Логвина, Наталия Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 132 с. : ил.

Список сокращений
1. Введение
2. Обзор Литературы. Взаимодействие белков с в-квадруплексами
2.1. Д-квадруплексы
2.2. Белки, взаимодействующие с ДНК-квадруплексами
2.3. Теломерные и теломер-ассоциированные белки, взаимодействующие с ДНК-квадруплексами
2.3.1. Белки ТЕВР и их структурные гомологи
2.3.2. Репликативный белок А (КРА)
2.3.3. Белки, взаимодействующие с двухцепочечной теломерной ДНК - 13ар1 и ТЯБг
2.3.4. Белки комплекса МКХ
2.3.5. Хеликазы
2.3.6. Белок ЕбИ
2.4. Заключение
3. Результаты и обсуждение
3.1. Получение и характеристика белков Еб13 и дикого типа и несущих замены аминокслотных остатков
3.1.1. Выбор и получение генов белков ЕэбЗ с заменами аминокислотных остатков, потенциально приводящими к нарушению взаимодействия с теломерной ДНК
3.1.2. Выделение и анализ биохимических свойств белков ЕзбЗ дикого типа, Еб131Ш0Е и Ез130164А
3.2. Формирование ДНК-квадруплексов
3.3. Взаимодействие белка Еб13 с ДНК-квадруплексами
3.3.1. Белок ЕбТЗ специфично узнает ДНК-квадруплексы

3.3.2. Узнавание ДНК-квадруплекса белком Ез13 основано на взаимодействии с петлями в структуре квадруплекса
3.3.3. Влияние ГТФазной активности на взаимодействие ЕэгЗ с ДНКквадруплексами
3.4. Взаимодействие белка Е513 с теломерной ДНК
3.5. Взаимодействие белка ЕбГЗ с РНК-квадруплексом
3.6. Заключение
4. Материалы и методы
4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы,
4.2. Методики, использованные в работе
4.2.1. Клонирование
4.2.3. Выделение белка Ез13
4.2.3. Измерение ГТФазной активности белков Еб13 дикого типа и Е513 с
заменами ЙИОЕ и й164А
4.2.4. Измерение констант димеризации белка Еб13
4.2.5. Методы работы с ДНК-квадруплексами
4.2.6. Методы изучения взаимодействия Еб13 с квадруплексами
4.2.7. Создание штаммов Е513:ЕЗНЗлД, Е513:ЕЗНЗ-Н110Е, Ез13:ЕЗЫЗ-0164А
4.2.8. Иммунопреципитация хроматина
5. Выводы
6. Список использованной литературы
Список сокращений
DBD - DNA-binding domain (ДНК-связывающий домен) FRET - флоуресцентный резонансный перенос энергии GMPPNP - ryaH03HH-5'-(ß, у-имидо)трифосфат О.nova (S.nova) - Oxytricha nova (Sterkiella nova)
Pi - фосфат-ион
S. cerevisiae - Saccharomyces cerevisiae
S.lemnae - Stylonychia lemnae
SDS - додецилсульфат натрия
ТЕВР - telomere end-binding rotein
TERRA-telomerase repeat RNA, hTERRA=(UAAGGG)n
Tris -трис(гидроксиметил)аминометан
БСА - бычий сывороточный альбумин
ГДФ - гуанозиндифосфат
ГМФ - гуанозинмонофосфат
ГТФ - гуанозинтрифосфат
Да, кДа -дальтон, килодальтон
ДМС - диметилсульфат
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТТ - 1,4-дитио-01.-треитол
ИПТГ - изoпponил-l-тиo-ß-D-raлaктoпиpaнoзид
н.о. - нуклеотидных остатков
п.н. - пары нуклеотидов
п.о. - пар оснований
п.о. - пары оснований
ПААГ- полиакриламидный гель
ПААГ - полиакриламидный гель
ПМСФ - фенилметилсульфонилфторид
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
ТЕМЕД - Ы,Ы,Ы',Ы'-тетраметилэтилендиамид
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия
ЭМ - электронная микроскопия

Холидея [228]. Для эффективного расплетания Sgsl требуется одноцепочечный З'-конец [228].
Однако эффективность связывания и расплетания G-квадруплексов хеликазой Sgsl больше, чем эффективность взаимодействия с двухцепочечной ДНК или структурами Холлидея [28, 229]. Эффективность расплетания различных субстратов лимитируется константами связывания этих субстратов хеликазой [229]. Для расплетания квадруплексов, как и для двухцепочечной ДНК, Sgsl необходим выступающий одноцепочечный З'-конец, АТР и Mg2+. Различные порфириновые сеодинения, стабилизирующие параллельные либо антипараллельные квадруплексы, ингибируют активность Sgsl, однако не затрагивают гидролиз АТФ [229, 230]. Для активного расплетания квадруплексов Sgsl достаточно центрального участка из аминокислот 400-1268 из 1447 аминокислот в полноразмерном белке. Этот участок содержит центральный консервативный хеликазный домен, который есть у всех хеликаз семейства RecQ [28]. Однако не все хеликазы RecQ семейства способны расплетать квадруплексы. Например, хеликаза RECQ1 не активна по отношению к G-квадруплексам, зато эффективно разрушает структуры Холлидея [231].
Белки WRNuBLM
Две RecQ хеликазы человека - WRN и BLM также участвуют в поддержании длины теломер. Фибробласты пациентов с синдромом Вернера (прогероз взрослых) обладают крайне низким потенциалом деления в культуре клеток, медленным ростом, быстро укорачивающимися теломерами и нестабильностью генома, что соответствует ускоренному старению самих пациентов. С большой вероятностью делеция гена WRN приводит к нарушению работы теломеразы, так как суперэкспрессия теломеразной каталитической субъединицы в культуре первичных фибробластов подавляет этот фенотип. Более того, у мышей с нокаутом гена WRN преждевременное старение наблюдается только на фоне отсутствия теломеразы.
Различными методами было показано, что in vivo WRN находится в теломерной
области в S-фазе, то есть во время репликации и удлинения теломер. В первичных
фибробластах WRN необходима для репликации отстающей Г-богатой цепи теломер
помощью FISH было показано, что отсутствие хеликазной активности WRN приводит к
потере теломер на сестринской хроматиде - фенотип потери сестринских теломер (sister
telomere loss - STL). В то же время потеря экзонуклеазной активности не влияет на
репликацию теломер. Предполагается, что WRN способствует полу-консервативной
репликации теломер, расплетая теломерные дуплексы либо образующиеся в отстающей G-