Синтез и исследование меченых тритием аминокислот, пептидов и белков с использованием твердофазных реакций

• Автор: Золотарев, Юрий Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 68 с. : ил.; 20х15 см

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.
Белки, пептиды и аминокислоты являются основой жизнедеятельности всех организмов, В основе функционирования многих важнейших процессов, происходящих в живой клетке, лежат белок-белковые взаимодействия и комплексообразование белков с низкомолекулярными лигандами пептидной и аминокислотной природы. Успех в исследовании этих процессов во многом определяется наличием соответствующих меченых препаратов. Особую ценность представляют биологически активные меченные тритием соединения. Это связано с тем, что водород присутствует во всех органических соединениях, а замещение его на изотопные атомы не приводит к изменению химической природы. Тритий выгодно отличается от многих других радиоактивных элементов своими ядерными свойствами. Он является мягким р-излучателем с энергией 18 КэВ и удобным для использования периодом полураспада, составляющим 11,2 года. Развитие современных методов детектирования трития делает использование меченных тритием соединений еще более эффективным. Особую ценность ДЛЯ исследования связывания пептидных регуляторов клеточных процессов представляют кратномеченные тритием препараты. Использование этих соединений делает возможным повысить чувствительность методов, основанных на их использовании.
В качестве препаративных методов для получения кратномеченных тритием аминокислот, пептидов и белков получили применение лишь немногие методы. Такие меченые аминокислоты и пептиды получают, в основном, гидрированием ненасыщенных соединений или дегалоидированием гапогенсодержащих соединений-предшественников в растворе газообразным нтгием в присутствии катализаторов платиновой группы. Основным способом получения меченных тритием белков является их химическая модификация с '«пользованием низкомолекулярных меченных тритием соединений. При этом меченый препарат уже не полностью химически соответствует исходному белку, поэтому возможно различное поведение меченых и нативных макромолекул при ургтографии и комплексообразовании. В случае пептидов наиболее ;|у иными оказываются препараты, содержащие метку по тирозиновому остатку, рые получают дегалоидированием соответствующего ди-иодтирозинового
производного. Это накладывает ограничения на доступность меченых тритием пептидов, не содержащих тирозинового остатка, и на предельную величину молярной радиоактивности меченого препарата. Использование соединений-предшественников, имеющих кратные связи на месте хиральных углеродных атомов меченой аминокислоты, делает необходимым проведение разделения меченых рацематов на оптические изомеры. Реакции каталитического гидрогенолиза в растворе позволяют вводить в большинство аминокислот не более 2-3 атомов трития. Известные методы не позволяли значительно повысить молярную радиоактивность препаратов аминокислот и пептидов, а равномерно меченные тритием соединения были недоступны.
В Лаборатории изотопно-замещенных физиологически активных соединений реакция твердофазного каталитического восстановительного дегалоидирования была впервые использована для получения меченных тритием компонентов нуклеиновых кислот4 Твердофазные реакции аминокислот, пептидов, белков и их производных с активированным водородом были выбраны в качестве объекта данного исследования. Как было показано в наших исследованиях, твердофазные реакции гидрирования и изотопного обмена биоорганических соединений происходят с участием активированного на катализаторе спилловер-водорода (CB)f Несмотря на то, что процессы, основанные на использовании СВ известны уже более 30 лет, нет общепринятого мнения о природе этих активированных частиц и механизме реакций с их участием. Поэтому представляется актуальным проведение исследования реакционной способности биоорганических соединений, выяснение основных закономерностей и механизма твердофазных реакций с участием спилловер-трития.
В связи с выше изложенным, представляется актуальным исследование твердофазных реакций гидрирования и изотопного обмена. Кроме того, данные, полученные в ходе выполнения этих исследований, позволили достичь увеличения молярной радиоактивности меченых соединений и создания универсальных методов синтеза биологически активных соединений. Данная работа является частью плановой тематики Лаборатории изотолно-замещенных
1 N.F. Myasoedov, eta], in Drg. Comp. Labeled by Radioisitopes, Prague, CKAE1977, p
2 P. A. Sermon, Catalysis Reviews. 1973, Я

более высокой температуре наблюдается равномерное распределение трития. Для характеристики относительной реакционной способности аминокислот в условиях реакции ВТКИО определяли отношение величин молярной радиоактивности, полученных на смеси двух аминокислот. Полученная при этом относительная активность отражает влияние строения аминокислот на их реакционную способность по отношению к СВ. Измерение относительной реакционной способности аминокислот позволило уменьшить влияние изменения активности катализатора, состава твердой и газовой фазы, а также других параметров реакции. Для этого исследования была выбрана температура 150чс. Такой выбор связан с тем, что при меньшей температуре не обеспечивается получение в результате реакции достаточного количества включенного в меченую аминокислоту трития, необходимого для проведения спектроскопии 3Н ЯМР. При большей температуре снижается региоселективность изотопного обмена. Относительная реакционная способность определялась по отношению к 6-валину и приведена в таблице 12. Там же показано распределение изотопной метки в алифатических аминокислотах, полученное при ВТКИО с тритием.
Таблица 12 Сравнительная реакционная способность аминокислот по отношению к 1-валину при реакции ВТКИО с тритием при 150°С.
Амино- кислота Относительная _ Распределение трития по аминокислоте, %
Активность 2 3
А!а 0,52 4 96
Аэл 0,75 40 60
Азр 0,25 40 60
Агд 2,53 19
С1у 0,23 100
Нур 0,58 6
Рго 0,63 9
Ме1 0,21
Ме1(0) 0,41
Меи02) 0
Бег 0.58 70 30
Бег(ОМе) 0,85 29 7 64
ТЬг 0,76 18 9 73
1еи 1,04 4
Не 0,95 4
1уэ 2,04 31 10
Уа1 1.0 4 4 92
Относительная реакционная способность /.-валина, лейцина и изолейцина близка. Эти аминокислоты содержат по две метальные группировки, являющиеся
наиболее реакционно способными в реакции ВТКИО. В молекуле /.-аланина