Структурно-функциональной исследование природных пептидных антибиотиков

• Автор: Овчинникова, Татьяна Владимировна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 52 с. : 26 ил.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования.
Стремительный рост числа патогенов, резистентных к антибиотикам, диктует насущную необходимость создания новых противоинфекционных лекарственных средств. В ряде случаев традиционные антибиотики уже не обеспечивают эффективного контроля над возбудителем при развитии хронических и рецидивирующих инфекционных заболеваний. Возрастающая
антибиотикорезистентность наблюдается в отношении ряда штаммов Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium и Pseudomonas aeroginosa, а также таких распространенных патогенов человека, как Staphylococcus aureus и Staphylococcus pneumoniae. Структурно-функциональное изучение природных пептидных антибиотиков показывает, что на их основе возможно создание новых антимикробных средств.
Эффективные механизмы защиты от патогенов вырабатывались многоклеточными организмами в процессе их эволюции. Лимфоцитарный иммунитет возник лишь с появлением челюстных рыб и существует менее чем у 2% видов многоклеточных организмов. Однако даже те из них, которые обладают способностью вырабатывать антитела, в первые часы встречи с патогеном могут полагаться только на защитные механизмы системы врожденного иммунитета. Эндогенные антимикробные пептиды (далее АМП) относятся к молекулярным факторам системы врожденного иммунитета, обеспечивающим выживание организмов в окружении патогенов (бактерий, грибков, простейших, вирусов). Распространенность АМП в природе и их структурное разнообразие дают основание полагать, что каждый биологический вид вырабатывает свой уникальный набор защитных пептидов, позволяющий ему успешно бороться с окружающей его патогенной микрофлорой. В настоящее время определены структуры около тысячи АМП, выделенных из различных тканей человека, позвоночных и беспозвоночных животных, растений, грибов и бактерий. Природные пептидные антибиотики обладают способностью инактивировать широкий спектр микроорганизмов. Поиск и исследование новых АМП позволяет лучше понять закономерности функционирования' врожденного иммунитета у человека. По мере углубления наших знаний о пептидных антибиотиках появляется все больше сведений об их участии в процессах регуляции иммунитета и регенерации тканей.
Наряду с фундаментальными исследованиями структурно-функциональных свойств АМП важное прикладное значение имеют работы по созданию эффективных лекарственных средств на их основе. Природные пептиды могут стать прототипами новых антибиотиков широкого спектра действия, способных решить проблему резистентности к существующим противоинфекционным средствам. Подавляющее большинство АМП относятся к мембранотропным антибиотикам, поэтому развитие резистентности патогенов, к ним менее вероятно из-за низкоизбирательного механизма их действия и возможно только при существенных изменениях структуры и свойств клеточной мембраны. Кроме того, многие АМП усиливают действие традиционных антибиотиков.
Известно, что длительная терапия антибиотиками в ряде случаев вызывает состояние иммунодефицита и эндотоксемию, однако многие АМП наряду с антибиотической обладают иммуномодулирующей и эндотоксин-нейтрализующей активностью. Все это создаёт предпосылки для создания новых эффективных антибиотических лекарственных средств на основе природных пептидных антибиотиков, лишенных перечисленных выше недостатков. Учитывая наличие выраженной антибиотической и иммуномодулирующей активности у природных АМП, многие зарубежные фармацевтические компании уже приступили к созданию нового класса антибиотиков на их основе, а первые из них уже проходят клинические испытания. Структурно-функциональные исследования природных пептидных антибиотиков могут внести существенный вклад в развитие этого перспективного направления медико-биологической; науки, а разработка способов их получения’ с целью создания на их основе лекарственных средств нового поколения является одной из актуальных задач современной биотехнологии.
Диссертация выполнялась по разделам основных направлений научных исследований ИБХ РАН «Структура и функции белков и пептидов” и „Биотехнология”, утвержденных Ученым Советом ИБХ РАН. Работа проводилась при поддержке РФФИ; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы; ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»; ФЦП «Национальная технологическая база» на 2007-2011 годы; целевой программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».
Цель и задачи исследования.
Цель данной диссертационной работы состоит в исследовании структуры, биологических свойств и молекулярных механизмов действия природных пептидных антибиотиков, а также в разработке биотехнологических способов их получения. Объектами исследования являются антимикробные пептиды ареницины из целомоцитов морского червя Arenicola marina [тип — кольчатые черви (Annelida), класс - многощетинковые (Polychaeta)]; аурелин из мезоглеи сцифоидной медузы Aurélia aurita [тип — кишечнополостные (Gnidaria), класс - сцифоидные (Scyphozoa)]; буфорин из желудка азиатской'жабы Bufo bufo gargarizans [тип — хордовые (Chordata), класс - земноводные (Amphibia), отряд — земноводные бесхвостые (Anura), семейство - жабы настоящие (Bufonidae)]; дефенсин и липид-траспортирующий белок из чечевицы обыкновенной Lens culinaris [отдел — покрытосеменные (Magnoliophyta), класс - двудольные (Dicotylédones), порядок - бобовоцветные (Fabales), семейство — бобовые (Fabaceae), подсемейство - мотыльковые (Faboideae)]; зервамицин и антиамебии из мицелиальных спорообразующих грибов Emericellopsis salmocynnemata и Emericellopsis minima [отдел - настоящие грибы (Eumycota), подотдел — аскомицеты (Ascomycotina), класс - эуаскомицеты (Euascomycetes)]; латероцидин и латероцин из аэробной грамположительной бактерии Brevibacillus laterosporus; лихеницидин из терморезистентной грамположительной бактерии Bacillus licheniformis.

Известно, что максимальный выход пептаиболов наблюдается при культивировании грибов-продуцентов на полноценной среде с высоким содержанием глюкозы. В наших предварительных опытах было установлено, что использование даже половинных концентраций компонентов среды приводит к резкому снижению уровня накопления пептаиболов. На основании этих данных было сделано предварительное заключение, что ростовые среды для получения препаратов тотально меченых зервамицина IIB и антиамебина I должны содержать ростовые факторы в тех же концентрациях, что и в стандартной полноценной среде для Е. salmosynnemata и Е. minima. Таким образом, для тотального включения стабильной изотопной метки в молекулы пептаиболов необходимо, чтобы абсолютно все ростовые субстраты были тотально меченными стабильными изотопами.
Культивирование штаммов-продуцентов проводили на полноценных тотально 15N- или (|3С+ 5Ы)-меченых средах. Коммерческие тотально I5N- и (15Ы+13С)-меченые. полноценные ростовые среды (обычно на основе изотопно-меченой биомассы микроводорослей), как правило, являются дорогостоящими. При приготовлении полноценных ростовых сред, тотально меченных стабильными изотопами, мы использовали автолизаты клеток и экзополисахариды облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum КТ, выращенных на тотально 15N- или (13C+15N)-меченой минимальной среде. Во втором случае в среду добавляли 13С-меченый метанол в качестве единственного источника углерода. Автолизаты биомассы, охарактеризованные по их питательной ценности, использовали в таком разведении, которое являлось адекватной заменой стандартной полноценной среде на основе смеси бакто-пептона и дрожжевого экстракта. При этом вместо экзогенной глюкозы и крахмала в состав среды вводили требуемое количество |3С,15Н~меченых экзополисахаридов, синтезированных теми же метилотрофными бактериями.
Таблица 7. Состав тотально меченых полноценных ростовых сред для получения препаратов тотально меченых зервамицина ИВ и антиамебина I.
Полноценные среды Источники азота и углерода Дополнительный источник углерода
Стандартная среда Бакто-пептон, дрожжевой экстракт Крахмал, глюкоза
ь№меченая среда Автолизат '^-меченой биомассы метилотрофов Крахмал, глюкоза
( N+UC)-меченаясреда Автолизат (‘ДчН-13С)-меченой биомассы метилотрофов 1:ЪГ,|3С-меченые экзополисахариды, [и-13С1-меченая глюкоза*
* - добавляли в части экспериментов.
Наработка тотально меченой биомассы и экзополисахаридов с использованием облигатных метилотрофных бактерий Ме1ку1оЬасШи$ Аа^еИаШт КТ и подбор сред для культивирования грибов-продуцентов пептаиболов проводились совместно с ГНЦ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов (д.б.н. Д.А.Складнев).