IL-4d2 - альтернативная форма IL-4: изучение структуры и разработка тест-системы

• Автор: Башкатова, Юлия Николаевна
• Шифр специальности: 14.00.36
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : 16 ил.

Введение.
Глава 1. Биологические свойства и методы анализа цитокинов.
1.1. Введение
1.2. Классификация цитокинов.
1.3. Биологическая активность цитокинов
1.4.Рецепторы цитокинов
1.5.Методы определения цитокинов.
1.5.1. Определение по биологическим эффектам.
1.5.2. Определение внутриклеточного содержания.
1.5.3. Количественное определение цитокинов с использованием антител
1.6.Интерлейкин4 1Ь4
1.6.1. Огкрытие
1.6.2. Структура 1Ь4
1.6.3.Физиология 1Ь4
1.6.4.Возможность регуляции активности 1Ь4 в терапевтических целях
1.7. Альтернативный сплайсинг
1.7.1. Типы альтернативного сплайсинга.
1.7.2. Биологическая роль альтернативного сплайсинга
1.7.3. Экспрессия и физиология ГЬ2
1.7.4. Рекомбинантный 1Ь2.
1.7.5. Структура 1Ь2
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Лабораторные животные.
2.2. Основные реагенты и расходные материалы.
2.3. Молекулярное моделирование
2.4. Пептидный синтез
2.5. Отщепление пептида от смолы.
2.5.1. Состав реакционной смеси для снятия пептида со смолы в зависимости ог аминокислотного состава пептида.
2.6. Очистка пептидов
2.7. Синтез стартовых аминокислот.
2.8. Конъюгирование пептидов и рекомбинантных белков с гемоцианином виноградной улитки .
2.9. Получение поликлональных антител к 4 человека.
2 Забор крови и получение сывороток
2 Получение моноклональных антител к I4 и I2 и ангипептидных моноклональных антител
2 Определение класса иммуноглобулинов в супернатантах
2 Наработка асцитных жидкостей мышей носителей гибридом, продуцирующих моноклональные антитела
2 Очистка антител
2 Биотинилирование очищенных моноклональных антител
2 Наработка поликлональных антител к пептидам, конъюгатам пептидов с и рекомбинантным белкам
2 Иммуноферментный анализ ИФЛ
2 Дотблот с использованием в качестве конъюгата стрептавидинмеченной щелочной фосфатазы .
2 Дотблот с использованием в качестве конъюгата стрсптавидинмеченной полимерной пероксидазы .
2 Иммуноферменттный анализ в формате сэндвичИФА.
2 Получение тимоцитов и эксперименты по стимуляции синтеза цитокинов I4 и I2 i vi
2 Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Теоретический анализ грехмерой и антигенной структуры I2.
3.2.Г1олучение моноклональных антител МКА к I4 и I2 и их анализ
3.3. Определение изотипов МКА.
3.4. Иммунохимический анализ района сплайсинга цитокина I2
3.5. Анализ 14 и 12 с помощью моноклональных антител в формате дотблота.
3.6. Конструирование сэндвичИФА тестсистемы.
3.7. Анализ супернатантов от стимулированных тимоцитов на наличие I4 и I2
Глава 4. Обсуждение результатов.
Глава 5
Выводы.
Список литературы


Эти клетки, в свою очередь, активируются Т-эпитопами аллергенных белков, которые нарезаются в антиген-экспрессирующих клетках и экспрессируются в виде комплексов с молекулами главного комплекса гистосовместимости второго класса (МНС-). Ь-5,- и 1Ь-. Эти цитокины модулируют функцию В-лимфоцитов, моноцитов, дендритных клеток и фибробластов, стимулируют переключение продукции антител В-клетками с ^О-изотипа на ^Е-изотип. С другой стороны, клетки Тх1-типа, задействованные в иммунной защите от чужеродных антигенов, секретируют цитокины с «антиаллергенными» свойствами: 1Ь-2, 1Ь-, 1Е-у. У лиц с аллергией число этих клеток и их активнось значительно снижается [,]. Е-антител, в основном, зависит от соотношения цитокинов . Ь-4 является, по-видимому, эффективным подходом к аллерготсрапии. Да, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, тучными клетками и базофилами. Он обладает широким функциональным спектром, поэтому не удивительно, что изменение его активности во многом определяет исход ряда патологических состояний, например при лейшманиозе, проказе, шистосомозе, аллергических заболеваниях и астме. Недавно был описан новый механизм регуляции активности 1Е-4 с участием альтернативной формы этого белка — 1Ь-2. Альтернативная форма белка П. ТЬ-4 образуют одну открытую рамку считывания. В тимоцитах и клетках бронхиального экссудата уровень экспрессии мРНК 1Ь-2 выше по сравнению с мРНК . Г.-2. Т- лимфоцитов, а также конкурирует с полноразмерной формой белка за общие рецепторы на иммунокомпетентных клетках. Из имеющихся в литературе данных следует, что 1Г. Предполагают, что . Е, приводящим к снижению его уровня в плазме/сыворотке и на поверхности клеток-мишеней - тучных клеток и базофилов. В связи с этими воззрениями мониторинг, П. Анализ динамики его концентрации в крови позволит прослеживать процессы реконвалесценции при атопической бронхиальной астме и аллергических ринитах, наиболее распространенных в мире сезонных заболеваниях. Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов в процессе терапии больных атопической астмой и поллинозами. Цель работы: анализ пространственной и антигенной структур цитокииов 1Ь-4 и 1Ь-2, поиск дискриминирущих моноклональных антител для обоих цитокииов, разработка системы для количественного определения 1Ь-2 в биологических образцах. Изучить трехмерную структуру цитокииов 1Ь-4 и 1Ь-2. Провести анализ и предсказание наиболее вероятных В-доминантных эпитопов белков 1Ь-4 и ГЬ-2. Синтезировать набор пептидов, имитирующих В-доминантные эпитопы обоих изучаемых белков. Получить моноклональные и поликлональные антитела, специфичные к ГЬ-4 и 1Ь-2. Изучить варианты дизайна тест-системы для количественного определения 1Ь-2. Проведен анализ антигенной и трехмерной структур цитокинов человека - 1Ь-4 и его альтернативного сплайсинг-варианта 1Ь-2. Используя наработанные моноклональные и поликлональные антитела и синтетические пептидные фрагменты этих цитокинов, локализованы доминантные В-эпитопы. Впервые получено моноклональное антитело, специфичное для 1Ь-2. Полученная информация использована для разработки системы для количественного определения 1Ь-2 в биологических образцах. Доступность количественного анализа открывает возможность изучения механизмов регуляции экспрессии и активности цитокинов группы 1Ь-4, взаимосвязи между экспрессией мРНК и соответствующей белковой формой. Ввиду того, что 1Ь-2, является антагонистом полноразмерного 1Ь-4, анализ динамики концентрации обоих цитокинов в крови позволит прослеживать процессы реконвалесценции при аллергических заболеваниях, атопической бронхиальной астме и ринитах, наиболее распространенных в мире сезонных заболеваниях. Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов при терапии аллергических заболеваний. Разработанная тест-система для количественного определения концентрации 1Ь-2 в биологических образцах может быть использована в мониторинге заболеваний, связанных с повышенной секрецией 1Ь-4.