Индукция гибели опухолевых клеток человека новой невирусной системой на основе дикатионных липидов, гена тимидинкиназы HVS-tk и ганцикловира

• Автор: Московцев, Алексей Александрович
• Шифр специальности: 14.00.16
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 0 с. : 148 ил.

1 .Молекулярная биотехнология и генетическая инженерия в

практической медицине. Клинические протоколы генной

терапии

2. Методы доставки генетического материала в клетки i vi

и i viv, невирусные векторные системы.

3.Индукция гибели клеток. Механизмы апоптоза, ответ на

повреждение ДНК.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2.1. Культура клеток 7

2.2.2. Культура клеток 3
2.2.3. Культура клеток
2.2. Материалы исследования
2.2.1 .Плазмидные ДНК репортерные пДНК V
, терапевтическая пДНК 9
2.2.2. Катионные димеры ДЭГАЗ, ДЭГА7, ДЭГАДЭГА
2.2.3. Липофектин
2.2.4. Антибиотики для селекции, ганцикловир.
2.2.5. Флуоресцентные зонды.
2.3. Методы исследования
2.3.1 Культивирование клеток.
2.3.2. Выделение и наращивание в препаративных количествах
плазмидных ДНК репортерные V,
1 и терапевтическая 9, электрофорез ДНК
2.3.3. Химический синтез катионных бисамфифилов ДЭГАЗ,
ДЭГА7, ДЭГА, ДЭГА
2.3.4. Анализ конформаций молекул катионных димеров.
2.3.5. Исследование физикохимических характеристик ДЭГА
критический параметр упаковки, критическая концентрация
мицеллообразования, температура фазового перехода.
2.3.6. Получение липосом на основе катионных димеров
ДЭГАЗ, ДЭГА7, ДЭГА, ДЭГА. Образование липоплексов.
Тропность ДЭГАвезикул.
2.3.7. Определение распределения частиц дисперсных систем
ДЭГ А и липоплексов по размерам с помощью корреляционной
спектроскопии светорассеяния
2.3.8 Атомная силовая микроскопия липосом и липоплексов.
2.3.9. Определение цитотоксичности липосомных препаратов
катионных димеров в культурах клеток МСР7,3,1игка1 с
помощью Мтеста
2.3 Оценка эффективности трансфекции липоплексами
ДЭГА с применением цветной реакции хва и световой микроскопии, флуоресцентной микроскопии, проточной
цитометрии
2.3 Индукция клеточной гибели ганцикловиром. Селекция
трансфецированных клеток с помощью антибиотика геосш.
2.3. Подтверждение экспрессии клетками тимидинкиназы
вируса простого герпеса с помощью ДТРСЯ
2.3 Детекция деполяризации митохондриальной мембраны
с помощью красителя КМ и конфокальной сканирующей микроскопии.
2.3 Определение активации фактора транскрипции ЫРкВ.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Химическая структура катионных бисамфифилов ДЭГА
3.2 Конформации молекул катионных димеров
3.3 Физикохимические характеристики ДЭГА
мембранообразующие свойства, критические концентрации мицеллообразования, температуры фазового перехода.
3.4 Размеры везикул дисперсных систем ДЭГА. Атомная силовая микроскопия везикул ДЭГА, ЕЮТМАООРЕ и плазмидной ДНК
3.5 Размеры и морфология липоплексов.
3.6 Цитотоксичность катионных димеров ДЭГА
3.7 Тропность везикул ДЭГА к мембранам клеток МСР7.
3.8 Эффективность трансфекции липоплексами на основе ДЭГА культур клеток.
3.9 Цитотоксическое действие эффекторного комплекса ДЭГ АЗрЦТ9ЗСУ
3. Селекция трансфецированных р1Л9 клеток
3. Деполяризация митохондриальной мембраны при действии системы ШУкССУ.
3. Активация транскрипционного фактора ОТкВ р в
ответ на действие системы НБУчкУССУ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Генетический материал в протоколах генной терапии может быть представлен а плазмидной или модифицированной вирусной ДНК РНК, содержащими терапевтический ген либо непосредственно, либо обратно транскрибируемый с РНК б короткими олигонуклеотидными последовательностями антисмысловыми, взаимодействующие с мРНК клетокмишеней РаШ е1 а. Таким образом, конечной целью генотерапевтического протокола является функционирование в клеткахмишенях генной конструкции и обусловленный этим биологический эффект. Устойчивая генетическая трансформация трансгенез, основанная на внедрении генноинженерной конструкции в участок хромосомной ДНК, может приводить к существенному изменению работы собственных генов и целых участков генома организма т. Однако вследствие неспецифической интеграции генноинженерной конструкции может происходить разрушение структурной части гена кодирующей области, цистрона, ведущее к существенным нарушениям метаболизма и, как следствие, к появлению нежизнеспособных организмов. В отличие от трансгенеза, временная генетическая коррекция представляет собой такое изменение метаболизма в клетке, при котором происходит модуляция экспрессии собственных генов или временная экспрессия введенных извне генетических конструкций. В первом случае введенные антисмысловые конструкции и олигонуклеотиды, селективно связывающиеся с нуклеиновыми кислотами, оказывают влияние только на регуляторные элементы генома клетки , , ii . По данным ii, ii , в мире насчитывается протоколов генной терапии, большая часть которых проводится в клиниках на территории США рис. Генная терапия имеет статус экспериментальной. Великобритания 3 . Рис.