Разработка средств и методов лабораторной диагностики пограничной болезни овец

• Автор: Луговцев, Владимир Юрьевич
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 153 с. : ил.

Содержание

4.3.2.1. Реакция нейтрализации

4.3.2.2. Методы на основе иммуноферментного анализа

4.3.3. Дифференциальная диагностика

4.4. Заключение по обзору литерату ры

5 Собственные исследования

5.1. Материалы

5.1.1. Вирусы

5.1.2. Животные

5.1.3. Культуры клеток 3

5.1.4. Питательные среды

5.1.5. Сыворотки
5.1.6. Ферменты
5.1.7. Химические реактивы
5.1.8. Оборудование
5.2. Методы
5.2.1. Культивирование вирусов
5.2.2. Титрование вирусов
5.2.3. Получение специфических антисывороток
5.2.4. Приготовление очищенных I
5.2.5. Оценка прокоагулянтной активности лейкоцитов
5.2.6. Постановка реакции торможения миграции лейкоцитов
5.2.7. Получение фракции лейкоцитов крови
5.2.8. Постановка для титрования антител.
5.2.9. Определение антигенного родства .
5.2 Исследование полевых сывороток крови овец и коз
5.2 Компьютерный анализ, расчет олигонуклеотидов
5.2 Синтез кДНК и клонирование
5.2 Постановка ОТПЦР
5.2 Электронная микроскопия вируса ИБО
5.2 Определение концентрации белка
5.2 Коныогирование I с ФИТЦ
5.2 Лиофилизация биологических материалов
5.2 Методы статистической обработки данных
5.3. Результаты собственных исследований
5.3.1. Культивирование вируса ПБО i vi
5.3.1.1. Выбор наиболее чувствительной клеточной системы для культивирования вируса ПБО
5.3.1.2. Изучение динамики накопления вируса ПБО в культуре клеток
5.3.1.3. Оптимизация условий культивирования вируса ПБО в культуре клеток 5
5.3.2. Лиофилизация вируса ПБО
5.3.3. Концентрирование, очистка и электронная микроскопия вируса ПБО
Содержание
5.3.4. Изучение инфекции, обусловленной вирусом ПБО, у овец и свиней
5.3.4.1. Воспроизведение болезни на овцах
5.3.4.2. Экспериментальное инфицирование свиней
5.3.4.3. Результаты изучения горизонтальной внутривидовой и межвидовой передачи вируса ПБО
5.3.4.4. Динамика уровня антител у животных, инфицированных вирусом ПБО
5.3.5. Сравнение активности лейкоцитов периферической крови, инфицированных разными пестивирусами
5.3.5.1. Определение прокоагулянтной активности
5.3.5.2. Оценка развития гииерчувствительности замедленного типа при ПБО
5.3.6. Разработка методов лабораторной диагностики ПБО
5.3.6.1. Получение специфических антител к вирусу ПБО
5.3.6.2. Отработка реакции прямой иммунофлюоресценции для идентификации вируса ПБО
5.3.6.3. Выделение в культуре клеток вируса ПБО из патматериала от экспериментально инфицированных животных
5.3.6.4. Разработка для выявления антител против вируса ПБО
5.3.6.5. Дифференциация и определение антигенного родства пестивирусов
5.3.6.6. Разработка ПЦР для диагностики ПБО
5.3.7. Ретроспективная оценка полевых сывороток крови овец и коз
5.3.8. Схема лабораторной диагностики ПБО
6 Обсуждение
7 Выводы
8 Практические предложения
9 Список литературы
Список сокращений
2 Список сокращений
ВДКРС вирусная диарея КРС
гзт гиперчувствительность замедленного типа
ГК гонады козы
ЗФР забуференный физиологический раствор, 7,,
ин индекс нейтрализации
ИФА иммуноферментный анализ
ККИД ная культуральноклеточная инфекционная доза
КРС крупный рогатый скот
КСТ коронарные сосуды теленка
кчс классическая чума свиней
моноклональные антитела
ОТПЦР обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция
ПВО пограничная болезнь овец
ПКА прокоагулянтная активность
ПО почка овцы
п.о. пары оснований ДНК
ПС почка сайги
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭАК почка эмбриона африканской козы
ПЭГ полиэтиленгликоль
ПЯ почка ягненка
РДП реакция диффузной преципитации
РИФ реакция иммунофлуоресценции
НРИФ реакция непрямой иммунофлуоресценции
реакция нейтрализации
РНК рибонуклеиновая кислота
РСК реакция связывания комплемента
РТМЛ реакция торможения миграции лейкоцитов
тк тестикулы козленка
Трис трисгидроксимстиламиномстан
ТФ ИФА твердофазный иммуноферментный анализ
т Я тестикулы яге ненка
ФБР 0 М фосфатный буферный раствор 7,
ФВК фосфорновольфрамовая кислота
ЦНС центральная нервная система
ЦПД цитопатогенное действие
ВТ трахея КРС
трахея эмбриона КРС
почка эмбриона овцы
I иммуноглобулин
почка КРС
хороидальное сплетение мозга овцы
5 5нетранслируемая область генома
введение


В этот период иммунная система плода приобретает способность к адекватному реагированию на вирус ИБО. При внутриутробном заражении на более ранних стадиях развития организм плода не в состоянии противостоять вирусу, и, если инфицированный плод выживает, то при последующем формировании иммунной системы, он приобретает специфическую иммунотолерантность, которая сохраняется на протяжении всей жизни и предопределяет пожизненную персистенцию вируса в данном организме. В то же время, инфицирование гетсрологичными штаммами сопровождается развитием полноценного иммунного ответа , 5, 3. Инфекция, возникающая позже го дня беременности сопровождается выработкой иммунной системой плода специфических антител 7, 9, 3. У персистентно инфицированных животных вирус и вирусный антиген могут обнаруживаться в тканях практически всех органов, что свидетельствует о г енерализации инфекции 3, 4. При этом вирус постоянно выделяется во внешнюю среду, особенно с носовыми истечениями и слюной. Поражение желез внутренней секреции обусловливает гипомиелиногенез и неполноценное развитие центральной нервной системы ДНС, нарушения внутриматочного развития, неправильное формообразование плода, а также проявление характерных клинических признаков у новорожденных , , , 7, 5, 1. Случаи гидроцефачии и другие, наблюдаемые при вскрытии, тяжелые поражения ЦНС, связанные с церебральной дисплазией, обычно встречаются при инфицировании овцематки в первой половине суягности на сутки 2. Изменения в коже и шерстном покрове связаны с нарушением развития и дифференциации первичных волосяных фолликулов, что проявляется у пораженных ягнят тонкорунных и полутонкорунных пород овец образованием шерстных волокон с гипертрофированным мозговым слоем , 2,3. Обзор литературы
Иногда у персистентно инфицированных овец спонтанно развивается синдром, клинически напоминающий болезнь слизистых у КРС. Вирус, выделенный от этих животных, обычно цитопатогенный, если культивируется во вторичной культуре клеток почки эмбриона овцы. Такая форма болезни может быть воспроизведена путем суперинфицирования персистентно инфицированных ягнят цитопатогенным вирусом ГБО, взятым из пула вируса, использованного для заражения их матерей. В данном случае необходимым условием является близкая антигенная гомология между нецитопатогенным и цитопатогенным штаммами вируса , , , , 5, 4. В ряде случаев пестивирусные инфекции у парнокопытных, а именно у свиней при КЧС и у КРС при ВДКРС, сопровождаются сильным поражением сосудистой и гемостатической систем, с проявлением геморрагического синдрома , . Сообщалось, что одной из причин, обусловливающих нарушения в системе свертывания крови при КЧС, является высвобождение прокоагулянтов медиаторов воспаления из клеток лимфоидных тканей, разрушающихся при вирусной инфекции 2, . Прокоагулянтная активность ПКА может индуцироваться моноцитамимакрофагами i vi и i viv в ответ на антигены, лсктины, липополисахариды и другие патогены . Описано несколько различных зилов прокоагулянтов, которые сильно различаются в отношении их взаимодействий с другими белковыми факторами системы свертывания. Одним из ключевых прокоагулянтов, инициирующих геморрагические осложнения, является тканевой фактор, который также называют фактором III или тромбопластином , . Повышенную индукцию тромбопластина связывают с патогенезом ряда инфекционных заболеваний, связанных с геморрагическим синдромом филовирусные инфекции, желтая лихорадка, лихорадка денге, чума собак, болезнь Ьорна у новорожденных крыс, сверхострый гепатит мышей и др. В некоторых исследованиях , было показано изменение ПКА в лейкоцитах крови свиней при острой форме КЧС, сопровождающейся геморрагическим синдромом. I.I увеличивалась на 4 сутки после заражения и возвращалась к норме только перед гибелью животных. При исследованиях i vi заражение вирусом КЧС лейкоцитов свиней также приводило к повышенному образованию и секреции ими прокоагулянтных веществ. В отношении других пестивирусных инфекций информации по данной проблеме в доступной литературе не найдено.