Разработка ПЦР тест-системы для идентификации энтерогеморрагических E.COLI и дифференциации E.COLI О157:H7

• Автор: Брюсова, Мария Борисовна
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

1. Характеристика возбудителя

1.1. Систематика и классификация.

1.2. Морфологические, культуральные и ферментативные свойства эшерихий

1.3. Антигенные свойства эшерихий.

2. Факторы патогенности энтерогеморрагических эшерихий и их роль в

ПАТОГЕНЕЗЕ.

2.1. КОЛО ШЗАЦИЯ КИШЕЧНИКА ЭГКП.

2.2. ШИГАПОДОБНЫЕ ВЕРОЦИТОТОКСИНЫ

2.2.1. Номенклатура шигатоксииов

2.2.2. Биологические свойства шигатоксииов.

2.2.3. Строение шигатоксииов и их патогенетическое действие

3. Эпидемиология и эпизоотология возбудителя 2Ц
4. Экология энтерогеморрагических эшерихий.К
5. Методы выделения и идентификации энтерогеморрагических эшерихий
6. Принцип полимеразной цепной реакции.
7. Заключение
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе
2. Культивирование бактерий и определение концентрации
3. Клинический материал и его подготовка
4. Методика выделения геномной ДНК из исследуемого материала методом протеи иазиой обработки и осаждения этанолом с предварительной фенольной экстракцией.
5. Методика выделения геномной ДНК из исследуемого материала методом аффинной сорбции ДНК на силикагеле
6. Методика проведения реакции амплификации.
6.1 Состав реакционной смеси, условия амплификщпи
6.2 Горячий старт
7. Методика проведения электрофореза в агарозном геле.
8. Клонирование фрагментов ПЦР в фаг А.сг.
8.1 ОчистюI фрагментов ПЦР.
8.2 Рестрикция фрагмента ПЦР
8.3 Гельэлектрофорез, элюция фрагмента из геля.
8.4 Реакция лигирования.
8.5 Упаковка фаговых частиц.
8.6 Приготовление клеток Е. сои.
8.7 Высев упакованных частиц фага.
8.8 Отбор клонов и элюция фаговых частиц
8.9 Наращивание рекомбинантных фаговых частиц.
9. Секвенирование.
9.1 Подготовка матрицы ДИК очистка продуктов ПЦР.
9.2 Измерение концентрации ДНК на флюориметре.
9.3 Секвенирующая амплификация
9.4 Очистю от невстроившнхся ддНТФ.
9.5 Детекция продуктов секвенпрования.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
1. Выбор олигонуклеотидиых праймеров и изучение их специфичности
2. Подбор условий ПЦР
2.1. Выбор оптимальном концентрации ионов Лг.
2.2. Оптимизация температуры отжига праймеров.
2.3. Подбор концентрации праймеров.
2.4. Применение горячего старта.
3. Подбор методов выделения очистки ДНК.
4. Внутренний контрольный образец ВКО.
5. Отрицательные и положительные контрольные образцы
6. Состав разработанной тестсистемы
7. Определение аналитической специфичности и чувствительности тестсистемы
8. Исследование фекалий от животных с помощью тестсистемы КОЛИДИФ .
9. Комиссионные испытания ПЦРтестсистемы КОЛИДИФ.
. Изучение активности и стабильности ПЦРтестсистемы в зависимости от срока хранения
. Использование тестсистемы КОЛИДИФ для государственного контроля пищевой продукции и кормов
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
ЛИТЕРАТУРА


При проведениии мониторинга ЭГКП среди сельскохозяйственных животных в Европе, обнаружено, что в Германии около ,8 животных и 2,6 исследованных проб мяса крупного рогатого скота крс были заражены . Н7. При исследовании образцов мяса в Финляндии, данный показатель составил 1,4, а в Бельгии 1, . При проведении мониторинга1 ЭГКП серовара Н7 в хозяйствах Рязанской, Воронежской, Тульской и Орловской областей обнаружено, что носитсльство среди крс составляет 2,6, среди свиней 0,9 и птиц 0,8 , . Вспышки инфекции у человека возникают при употреблении пищевых продуктов животного происхождения, контаминированных эшерихиями в процессе убоя, переработки, упаковки, хранения и приготовления пищи, а также фруктов и овощей, обсеменение которых происходит в результате контакта с фекалиями домашних и диких животных на какойлибо стадии их выращивания или обработки. В Великобритании в период гг. ГК у людей, заболеваемость за это время возросла с 6 до 1 случаев на 0 тыс. Наиболее распространенным и значимым для здравоохранения серологическим вариантом ЭГКП является ссровар Н7, тем не менее, при спорадических случаях и эпизоотиях часто выявляются и другие серогруппы эшерихий 6, 1, , , , , , , , , , , 1, 5, 8, идентификация которых имеет немаловажное значение. Сложность определения энтерогеморрагических эшерихий обусловлена тем, что среди множества непатогенных близкородственных представителей необходимо выявлять единичные серогруппы, которые приобретают измененные свойства в результате генетических мутаций, и не имеют фенотипических свойств, прочно коррелирующих с патогенностью , , 0, 1, 6. Разработка новых высокочувствительных и специфичных экспресс методов для идентификации энтерогеморрагических . В последние годы широкое распространение во многих странах получил метод выявления факторов патогенности ЭГКП с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР. Большинство молекулярногенетических методик, разработанных для идентификации ЭГКП, направлены на прямое выявление генов, кодирующих веротоксины , , , 3, 0, 4, 7. ЭГКП не только в биологическом материале, но и в объектах внешней среды. Целью настоящей работы являлась разработка тестсистемы для идентификации энтерогеморрагических . Н7 методом ПЦР. Сконструировать олигоиуклеотидные праймеры для идентификации энтерогеморрагических . Провести комиссионные испытания ПЦРтсстсистемы для идентификации . Н7 и дифференциации веротоксинов энтерогеморрагических . ПЦР. Впервые сконструированы оригинальные праймеры для амплификации ДНК энтерогеморрагических . Н7 в формате электрофоретической детекции. Разработан положительный контрольный образец ПКО ДНК V1, V2, Н7, являющийся генноинженерной конструкцией, несущей вставки фрагментов генов x, 2 и i . ПКО позволяет контролировать работу амплификационной смеси и является маркером длины ПЦРпродуктов. Впервые в России разработана ПЦР тестсистема для идентификации Е. Впервые в России разработана и внедрена в ветеринарную практику тестсистема КОЛИДИФ для идентификации . Н7 и дифференциации энтсрогеморрагических . ПЦР. Использование метода ПЦР в диагностических лабораториях позволит в течение одного рабочего дня проводить анализ биологического материала, продукции животного происхождения, объектов внешней среды на наличие ЭГКП, а также дифференцировать серологический вариант Н7, тогда как идентификация ЭГКП бактериологическим методом занимает от 6 до 7 суток и требует применения дополнительного исследования для определения веротоксинов. С года на базе ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора аттестовано производство и налажен серийный выпуск тестсистемы КОЛИДИФ Аттестат от . Рекламаций на тестсистему в течение трех лет не поступало. Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета ФГУ ВГНКИ гг. Всероссийской научной конференции Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, посвященной летию ФГУ ВГНКИ Москва, г. Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием Молекулярная диагностика Москва, г.