Разработка и совершенствование средств и методов диагностики бруцеллеза и кампилобактериоза животных

• Автор: Скляров, Олег Дмитриевич
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 271 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы. 1

1.1. Бруцеллез 1

1.1.1. Краткая историческая справка. 1

1.1.2. Характеристика возбудителя бруцеллеза

1.1.2.1 Таксономия.

1.1.2.2. Геном 1

1.1.3. Краткий анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу 1

1Л .4. Резервуар и источники бруцеллезной инфекции

Л .5. Диагностика бруцеллеза животных
1.1.5.1. Серологические методы диагностики бруцеллеза
1Л .5.2. Аллергическая диагностика бруцеллеза.
1Л .5.3. Бактериологическая диагностика бруцеллеза 3
1.1.5.4. Молекулярногенетическая диагностика бруцеллеза 3
1.2. Кампилобактериоз. 4
1.2.1. Краткая историческая справка. 4
1.2.2. Характеристика возбудителя болезни.
1.2.2.1. Таксономия. 4
1.2.2.2. Морфологические свойства.
1.2.2.3. Культуральные свойства. 4
1.2.3. Эпизоотология заболевания 5
1.2.4. Диагностика кампилобактериоза животных. 5
1.2.5. Идентификация кампилобактерий 7
1.3. Анализ обзора литературы. 7
2. Собственные исследования.
2.1. Материалы и методы
2.1.1. Подготовка исследуемого материала
2.1.2. Выделение геномной ДНК из исследуемого материала .
2.1.3. Постановка ПЦР.
2.1.4. Очистка ампликонов методом фенольной экстракции . 9
2.1.5. Рестрикционный анализ
2.1.6. Электрофоретический анализ. 9
2.1.7. Изучение свойств кампилобактерий.
2.2. Результаты собственных исследований
2.2.1. Разработка ПЦРтестсистемы для выявления бруцелл 1
2.2.1.1. Краткое теоретическое обоснование основных принципов при разработке ПЦРтестсистем.
2.2.1.2. Определение чувствительности и специфичности праймеров 4
2.2.1.3. Оценка чувствительности и специфичности ГЩРтест
системы для выявления бруцелл 9
2.2.2. Оценка чувствительности ПЦРтестсистемы с использо
ванием молока, крови и спермы животных, контаминированных бруцеллами и крови морских свинок, инфицированных бруцеллами 3
2.2.3. Изучение чувствительности и специфичности ПЦРтест
системы в производственных условиях 0
2.2.3.1. Московская область 0
2.2.3.2. Смоленская область. 3
2.2.3.3. Волгоградская область 7
2.2.3.4. Краснодарский край. 1
2.2.4. Дифференциация видов и штаммов бруцелл. 0
2.2.4.1 Идентификация вакцинного штамма 0
2.2.4.2 Идентификация диссоциированных штаммов бруцелл 1
2.2.4.3 Дифференциация видов бруцелл, основанная на полиморфизме расположения в геноме бруцелл элемента I 1 4
2.2.4.4 Дифференциация всех биоваров В. 9
2.2.4.5 Использование ПЦРПДРФанализа для дифференциации В. и В. 1
2.2.5. Изучение дифференциальнодиагностических признаков
кампилобактерий 6
2.2.6. Разработка тестсистемы для выявления
i i i. 9
2.2.6.1. Краткое теоретическое обоснование основных принци
пов при разработке ПЦРтестсистемы для диагностики кампил обактериоза.
2.2.6.2. Изучение чувствительности и специфичности ПЦРтест
системы для выделения и идентификации кампилобактерий подвида i. 0
2.2.7. Конструирование питательной среды для выделения и
культивирования кампилобактерий 6
2.2.7.1. Сравнительное изучение разных питательных сред для
культивирования кампилобактерий 6
2.2 Определение оптимального состава питательной среды
на основе гидролизатов казеина. 8
2.2.7.3. Изучение селективных свойств СПК. 0
2.2.7.4. Изучение селективных и ростообеспечивающих свойств
СПК с использованием биологического материала 2
2.2.1.5. Сравнительное изучение ростообеспечивающих и селек
тивных свойств СПК и сред для кампилобактерий фирмы xi
2.2.7.6. Сравнительное изучение ростообеспечивающих и селективных свойств СГПС и МГ1ПА 4
Обсуждение результатов собственных исследований 9
Выводы 7
Практические предложения 9
Список литературы


С учетом результатов постановки РСК при различных температурных режимах была предложена РДСК, которая в некоторых случаях является более чувствительной и специфичной, чем РСК , 3, 1. Определенный интерес представляет обнаружение в инфицированном организме бруцеллезного антигена в РДСК с высокоактивной диагностической сывороткой . Возможность использования РДСК для обнаружения антител с целью ранней диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота была подтверждена исследованиями Аливердиева 3, 4. По данным Ромахова В. А., в свежих очагах бруцеллеза крупного рогатого скота, сыворотка крови которого не реагирует в РА и РСК, исследование материала от этих животных на наличие антигена в РДСК дает положительный результат. В дальнейшем такие коровы абортируют и уже положительно реагируют на бруцеллез в РА и РСК 8. Жованик П. Н. исследовал материал от 8 животных неблагополуч
ного по бруцеллезу стада в РДСК и обнаружил у голов бруцеллезный антиген. При этом пробы сыворотки крови от животных, у которых выявили наличие антигена, реагировали положительно в РА и РДСК . В последние годы отечественные и зарубежные исследователи для диагностики многих бактериальных и вирусных болезней у людей и животных рекомендуют использовать реакцию непрямой гемагглютинации РИГА. Уже в первой четверти века было известно, что эритроциты адсорбируют на своей поверхности продукты распада бактерий, их экзотоксины и антитела , . Эти данные послужили предпосылкой для изготовления эритроцитарных диагностикумов и разработки реакции непрямой гемагглютинации, которая прочно вошла в последние годы в лабораторную практику диагностики многих инфекционных болезней. Сущность этой реакции заключается в том, что эритроциты после адсорбции на их поверхности специфических растворимых антигенов различной природы полисахариды, липополисахариды, белки и др. Впервые при бруцеллезе РИГА была испытана . Для сенсибилизации эритроцитов они использовали надосадочную жидкость антигена из Я , применяемого для постановки РА, а также водный экстракт бруцелл 6. Я 0. О высокой чувствительности РНГА при бруцеллезе сообщают Тульчинская В. П. и Ищенко Н. И. 3. Несколько позже высокая чувствительность РНГА была установлена при исследовании на бруцеллез морских свинок и крупного рогатого скота. В ходе исследований авторам удалось выявить в этой реакции антитела в титрах 0 в сыворотках крови морских свинок на 3й день после иммунизации вакциной из штамма . При исследовании этих же сывороток в РА агглютинины в титрах были зарегистрированы лишь на дни. У крупного рогатого скота антитела в сыворотке крови были также обнаружены на 3й день после иммунизации. При этом титр РИГА в среднем равнялся , а РА 8. Ищенко Н. И. предложила РИГА для дифференциации поствакцинальных реакций от реакций у больных бруцеллезом животных. Сыворотки крови исследовали в РИГА, РА, РСК и в реакции преципитации РП. Для сенсибилизации бараньих эритроцитов ею был использован антиген, изготовленный по методу Тульчинской В. П. с помощью диэтилового эфира. У крупного рогатого скота, исследованного в отдаленные сроки после иммунизации противобруцеллезной вакциной 1,5 4,0 и более лет, результаты в РНГА были отрицательными, при положительных показаниях РА, РСК и РП. При исследовании сыворотки крови больных бруцеллезом коров с помощью РНГА было выявлено больше положительно реагирующих животных, чем в других реакциях. В частности, в РНГА реагировало ,6 животных, в РА ,4 и в РСК ,1 . Канатов Ю. В. и др. РНГА, РА и РСК сыворотки крови людей, иммунизированных и больных бруцеллезом, сделали вывод о более высокой чувствительности РНГА 8. Вершиловой П. А. с соавторами в опытах на морских свинках, зараженных подкожно вирулентной культурой В. Шетю, было установлено, что РНГА выявляет положительно реагирующих животных раньше, чем РА. Через , и дней после заражения, РА с сывороткой крови от всей группы животных была отрицательной, тогда как в РНГА спустя дней реагировали положительно сыворотки крови от 2, через дней от 6 и через дней от всех морских свинок 0.