Молекулярно-генетическая характеристика хламидий и экспресс-диагностика хламидиоза

• Автор: Обухов, Игорь Леонидович
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 351 с. : ил.

1.1. Свойства и цикл развития хламидий. Взаимодействие

с клеткойхозяином 1

1.2. Хламидиоз кошек и собак 5

1.3. Антигенная структура хламидий и получение антихламидийных моноклональных антител. 5
1.4. Молекулярногенетический подход в диагностике хламидиозов животных и птиц на основе полимеразной цепной реакции . .

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы. 7

2.2. Методы исследований

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. 8

3.1. Выделение хламидий в развивающихся куриных эмбрионах. 8

3.2. Выделение хламидий в культуре клеток . 7

3.3. Ультраструктурная характеристика .ii 2
3.4. Изучение патогенности штаммов К1 и С1 7
3.5. Изучение длительности хранения хламидийного штамма К1 1
3.6. Изучение чувствительности куриных эмбрионов различного возраста к штаммам К1 и С1., 6
3.7. Выращивание возбудителя хламидиоза в клеточных культурах. 9
3.8. Получение, характеристика и применение моноклональных антител к .ii 2
3.9. Характеристика гибридомы ХлаК1ДЕП. 3
3 Технологический процесс получения диагностического препарата для выявления антигенов хламидий у животных методом прямой иммунофлюоресценции ПИФ 2
3 Сравнение чувствительности и специфичности экспериментального диагностикума на основе флюоресцирующих моноклональных антител с зарубежными и отечественными аналогами. 2
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕСТСИСТЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗА И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИДОВ .II И . 8
4.1. Детектирование и видовая дифференциация хламидий методом ПЦР 8
4.2. Выбор методики выделения ДНК 4
4.3. Определение аналитической специфичности и чувствительности ПЦР 8
4.4. Внутривидовая дифференциация штаммов .ii методом рестрикционного анализа 5
4.5. Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики офтальмохламидиоза у кошек. 5
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 1
ВЫВОДЫ. 5
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ. 8
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Продуктом этого гена, повидимому, является гликозилтрансфераза, которая специфически прикрепляет к гидроксильной группе С8 концевого в липополисахариде. Структурные белки наружной мембраны. Как указывалось выше, представители i не имеют
пептидогликана, который у других грамотрицательных бактерий обусловливает структурную целостность и осмотическую резистентность, поэтому надмолекулярная сеть дисульфидных связей между белками наружной мембраны элементарных телец функционирует как эквивалент пептидогликанового слоя. Наружная мембрана содержит большое количество МОМР с перекрестными дисульфидными связями и два цистеинбогатых белка. В нестабильных ретикулярных тельцах МОМР не имеет перекрестных связей, и цистеинбогатые белки синтезируются и инкорпорируются в наружную мембрану хламидий на завершающих этапах цикла развития 5 5 1. Показано, что МОМР массой составляет наружной мембраны элементарного тельца 5. Восстановленный МОМР образует поры, которые ограничивают пассивную диффузию молекул массой от 0 до . Открытие и закрытие пор контролируется механизмом окислениявосстановления дисульфидных связей. В МОМР содержатся основные антигенные детерминанты сероваров всех видов хламидий 5 0. Сероварспецифические открытые антигенные детерминанты МОМР серовара В . В противоположность этому экранированные подвидо и видоспецифические, а также открытые родоспецифические антигенные детерминанты МОМР и липополисахариды хламидий не стимулируют образования антител,
предотвращающих токсический шок или способность хламидий к заражению 4. Ген отрА, кодирующий МОМР многих штаммов хламидий, был секвенирован 1 6 9 1 3. Установлено, что локус отрА высококонсервативен и вариабельность его нуклеотидных последовательностей между далеко отстоящими видами хламидий составляет приблизительно . Высококонсервативные области генов отрА прерываются четырьмя вариабельными доменами I, II, III и IV, причем I, II и IV домены кодируют пептиды, представляющие смежные видо, подвидо и серовароспецифические антигенные детерминанты 0. В консервативных областях пептидов МОМР представлено семь остатков цистеина. Между вариабельными доменами I и II был обнаружен амфипатический пептид, обладающий высокоэффективной антигенной активностью для Тхэлперов у мышей 1. Первичная последовательность пептида консервативна у всех хламидий, однако в некоторых штаммах СрэМаа обнаружена замена валина на изолейцин. Два цистеинбогатых белка наружной мембраны хламидий имеют молекулярную массу и кОа и кодируются соответственно локусами етА и етВ, расположенными на хромосоме тандемно. Цистеинбогатый белок массой кйа штамма 6ВС С. БЮаа содержит остатков цистеина и на идентичен белку СЛгасЬотайв, а белок массой кОа содержит остатков цистеина и на идентичен белку СгасИотайэ 5. Расположение цистеиновых остатков в обоих пептидах высококонсервативно. Повидимому, белок с низкой молекулярной массой присоединен к мембране элементарного
тельца посредством ковалентно связанной липидной части молекулы. Молярное соотношение цистеинбогатых белков массой , и основных белков наружной мембраны элементарных телец, рассчитанное для штамма 6ВС, составляет соответственно 5. Молекулы адгезии. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что в инициальном прикреплении хламидий участвуют углеводные и белковые макромолекулы инфекционных элементарных телец и клеткихозяина. Было описано несколько адгезинов хламидий для клеточных рецепторов, однако данные экспериментов по их выявлению посредством ингибирования связывания различных сахаров и гликопротеинов оказались неубедительными. Моноклональные антитела к вариабельным доменам антигенных детерминант I и IV блокируют прикрепление элементарных телец к клетке. Потеря способности элементарных телец к прикреплению обусловлена изменениями температуры и коррелирует с конформационными перестройками в консервативном гидрофобном нанопептиде вариабельного домена IV, также зависящими от температуры. Повидимому, температурная обработка элементарных телец открывает этот ранее недоступный участок для видоспецифичных моноклональных антител, что приводит к потере способности элементарных телец к адгезии и инфицированию 2.