Количественная характеристика иммуноглобулинов в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа

• Автор: Борзенко, Евгений Владимирович
• Шифр специальности: 16.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

1.ВВЕДЕНИ Е

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Иммунная система крупного рогатого скота структурная и функциональная характеристика

2.2. Иммуноглобулины крупного рогатого скота

2.3. Изотипы иммуноглобулинов функциональные свойства

2.4. Пассивная передача иммунитета

2.5. Количественные методы определения иммуноглобулинов.

2.5.1. Методы, основанные на реакции преципитации.

2.5.2. Методы, основанные на использовании меченых антител или антигенов.

2.6. Количественная характеристика иммуноглобулинов крупного рогатого скота

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Иммунологические реагенты
3.2. Испытуемые пробы биологического материала
3.3. Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони РДП.
3.4. Метод радиальной иммунодиффузии по Манчини РИД.
3.5. Методы иммуноферментного анализа.
3.6. Электрофорез в ПААГДСН
3.7. Иммуноблоттинг.
3.8. Синтез иммуноиероксидазных конъюгатов
3.9. Статистическая обработка результатов.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Разработка сэндвичИФА на основе моноклональных антител для количественного определения А крупного рогатого скота
4.1.1. Иммунологические реагенты, предназначенные
для использования в сэндвичИФА.
4.1.2. Иммунохимическая характеристика моноклональных
антител к I крупного рогатого скота.
4.1.3. Разработка сэндвичИФА на основе моноклональных антител
к крупного рогатого скота.
4.2. Разработка РИД на основе моноклональных антител для количественного определения А крупного рогатого скота.
4.3. Сравнительная оценка эффективности сэндвичИФА и РИД но определению уровня в биологических жидкостях крупного рогатого скота
4.4. Количественная характеристика иммуноглобулинов в, М и Аизотипов в биологических жидкостях коров
4.5.Возрастная динамика иммуноглобулинов у телят
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕННЫХ НАЗВАНИЙ
в иммуноглобулин иммуноглобулины
1М, иммуноглобулины классов изотипов б,МиА соответст
секреторный иммуноглобулин класса А МкА моноклональные антитела ИФА иммуноферментный анализ РИД радиальная иммунодиффузия РДП реакция двойной иммунодиффузии ПААГ полиакриламидный гель ДСН додецилсульфат натрия ПХ пероксидаза хрена ОП коэффициент оптического поглощения
ОП 2коэффициент оптического поглощения при длине волны 2 нм
БСА бычий сывороточный альбумин
КББ 0, М карбонатнобикарбонатный буфер, 9,
ФБ фосфатнобуферный раствор 0, М ЫазИРО 0, М ЫаС1, 7,2
ФБТ ФБ, содержащий 0, твин ОФД ортофснилендиамин
ЭДТАнатрия раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевой соли
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Сдерживающим фактором в проведении исследований в этих направлениях является отсутствие коммерческих сывороток против секреторного и соответствующих тестсистем для выявления иммуноглобулинов этого изотипа во внешних секретах организма крупного рогатого скота. Поэтому вопросы, связанные с разработкой и совершенствованием методов иммуноанализа на основе поли и моноклональных антител, также как и с их использованием для изучения функционирования иммунной системы крупного рогатого скота, являются весьма актуальными и представляют значительный интерес как в научном, так и в практическом аспектах. Цель исследования состояла в разработке тестсистем на основе методов иммунохимического анализа РИД и ИФА и изучении иммуноглобулинового профиля различных биологических жидкостей крупного рогатого скота для определения информативности показателей уровня иммуноглобулинов при оценке иммунного статуса. Методами физикохимического и иммунохимического анализа охарактеризовать моноклональные антитела к крупного рогатого скота. Разработать чувствительную и специфичную тестсистему на основе ИФА с использованием моноклональных антител сэндвичвариант для выявления и количественной оценки иммуноглобулинов Аизотипа в различных биологических жидкостях крупного рогатого скота молозиво, молоко, носовой секрет, слезна я жидкость. Оптимизировать условия проведения и учета результатов ИФА. Определить показатели нормальных значений иммуноглобулинов для таких биологических жидкостей крупного рогатого скота, как сыворотка крови, молозиво, молоко, слезная жидкость и носовые секреты. Провести сравнительное изучение диагностической ценности иммунохимических методов исследования РИД и ИФА при оценке иммунного статуса коров после отела и полученных от них телят после рождения. Изучить возрастную динамику становления местного иммунитета у телят в раннем постнатальном онтогенезе. Научная новизна и теоретическое значение исследования. Дана физикохимическая и иммунохимическая характеристика моноклональных антител к А крупного рогатого скота и на их основе разработаны специфичные методы сэндвичвариант твердофазного ИФА и РИД для выявления иммуноглобулинов Аизотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота. Определены значения иммуноглобулинов О, М и Аизотипов в сыворотке крови, носовом секрете, слезной жидкости, молозиве и молоке коров, а также в сыворотке крови, слезной жидкости и носовом секрете у телят. Установлено, что высокая чувствительность метода ИФА позволяет количественно определять уровень А в пробах с низким его содержанием. Впервые проведены сравнительные исследования по изучению иммунного статуса коров после отела и полученных от них телят после рождения, уста
новлена положительная корреляция результатов, полученных с помощью РИД и ИФА. Получены новые данные и подтверждены некоторые закономерности о становлении секреторной иммунной системы у телят в раннем постнатальном онтогенезе. Практическая значимость. Показана высокая информативность и целесообразность использования иммуноглобулинового анализа биологических жидкостей для оценки иммунного статуса животных, состояния системного и местного иммунитета. Определены границы нормальных значений иммуноглобулинов в секретах крупного рогатого скота с помощью иммуноферментного анализа. Разработан сэндвичвариант ИФА и РИД на основе моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов Аизотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота. Количественное определение уровня бА в молозиве, молоке, носовых и слезных секретах является основой оценки напряженности иммунитета слизистых и колострального иммунитета у телят. Полученные результаты составляют методическую основу дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования иммунитета у крупного рогатого скота. Результаты исследований вошли в методические рекомендации Количественное определение иммуноглобулинов в биологических жидкостях иммуноферментным методом, утвержденные Ученым советом ВИЭВ Москва, г. Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных, рассмотренные и утвержденные в установленном порядке Сибирским отделением РАСХН Новосибирск, . Основные положения, выносимые на защиту.