Конформационные различия нативной и рекомбинантной форм изофермента С пероксидазы хрена, выявляемые радиохимическими и кинетическими методами

• Автор: Чубарь, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 15.00.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с.

Что особенно важно, метод термической активации трития дает возможность изучения поверхности раздела фаз газ твердое тело, газ жидкость и адсорбционных слоев, так как структура поверхности и ее свойства привлекают к себе серьезное внимание исследователей Это связано с тем, что малая толщина реакционного слоя 3 А позволяет не только определить молекулярный состав поверхности, но и ориентацию молекул, например различить отдельные метиленовые группы в составе углеводорода, в разной степени удаленные от поверхности. Сегодня развит широкий спектр методов исследования поверхности, основанных как на измерении физических параметров, так и спектральных и химических с разрешающей способностью анализа от единиц до нескольких десятков ангстрем. Тритиевая планиграфия занимает в этой череде методов свое законное место. Имеется удачный опыт применения тритиевой планиграфии для исследования строения различного рода мембран и мембранных систем, например, при изучении бислойных мембран асимметричного состава, липосом, мицеллярных структур, мембран животных и растительных клеток и т. При рассмотрении надмолекулярных нуклеопротеидных комплексов фаги, вирусы, рибосома до сих пор исследователи ограничивались изучением белковых компонентов, не анализируя включение метки в нуклеиновые кислоты. Между тем тритиевая планиграфия позволяет определить индивидуальные нуклеотиды в их последовательности, и в дальнейшем можно получить информацию об их стерической доступности, то есть о пространственной структуре молекулы нуклеиновой кислоты и экранировке ее участков другими компонентами комплекса. Таким образом, современная тритиевая планиграфия это общий метод исследования биочастиц неизвестной стереоструктуры. В данной диссертации показаны возможности метода для уточнения структурных деталей процессов инактивации, вызванных, в частном случае, радиационным облучением фермента с известной кристаллической структурой. Такое совокупное использование ионизирующего излучения является новым направлением, особенно учитывая, что метод радиационной инактивации является одним из наиболее чувствительных к изменению структуры биомолекул. Объемом исследования была выбрана пероксидаза хрена, доступная в нашей лаборатории как в нативной форме, так и в рекомбинантной
дегпикозилированной форме. Пероксидаза хрена традиционно применяется в качестве метки в иммуноферментном анализе ИФА На основе метода ИФА разрабатываются и внедряются в медицинскую практику тестсистемы для определения различных веществ, таких как гормоны, онкомаркеры, аутоантитела, иммуноглобулины, лекарственные соединения и т д Иммуноферментные наборы используются для целей лабораторной диагностики инфекционных, аллергических и других видов заболеваний, для осуществления лекарственного мониторинга. ГЛАВА 1. Гемсодержащие пероксидазы КФ X, где X определяется природой биологического восстановителя подразделяются на 2 суперсемейства, пероксидазы растений и животных. Ферменты катализируют окисление различных электрондонорных субстратов перекисью водорода. Каталитический цикл начинается быстрым взаимодействием фермента и перекиси водорода с образованием т. Соединения I. Соединение I содержит 2 окислительных эквивалента оксиферрилгем и свободный радикал. Е, Е1 и БИ нативный фермент и его Соединения 1 и соответственно, и Р субстрат и продукт его одноэлектронного окисления. Формы пероксидазы хорошо различимы благодаря спектрам в видимой области, что позволяет измерять константы скорости элементарных стадий реакции методом остановленной струи. Суперсемейство пероксидаз растений классифицируется на 3 класса на основе гомологии аминокислотных последовательностей и особенностей посттрансляционной модификации 1. Класс I включает микробиальные прокариотические пероксидазы, а именно бактериальные каталазыпероксидазы КФ . Спероксидазу, СсР КФ . КФ Класс II это пероксидазы грибов, включающие лигнинпероксидазу, i, марганецпероксидазу, МпР, и секреторные пероксидазы растительного типа. Класс III это т. Пероксидазы двух последних классов КФ . Железо III протопорфирин IX и два дистальных аминокислотных остатка, i и необходимы для эффективного катализа Перекись водорода связывается с атомом железа и затем депротонируется i, который выполняет функцию основания.