Экспрессия генов в эпидерме для исследования развития цветка львиного зева и выведения сортов методом трансформации

• Автор: Ефремова, Надежда Николаевна
• Шифр специальности: 06.01.05, 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Краснодар
• Количество страниц: 161 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Львиный зев ЛпЬггЫпит та Ь. и арабидопснс

ii ФаПапа Ь. как модельные растения в биологии

развития для изучения морфогенеза цветка

1.1.1. Систематика, происхождение и биологические особенное львиною зева

1.1.2. Систематика, происхождение и биологические особенное арабидопсиса.

1.2. Цветковые морфогенегические мутанты львиного зева

1.3. Строение растительной меристемы и развитие львиною

зева и арабидопсиса

1.3.1.ослойное строение растительной меристемы

1.3.2. Строение и функции эпидермы

1.3.3. Экспрессия эпидермаспешфичных генов
1.3.4. Механизм, определяющий тип цветковых органов в цветочной меристеме АСмодель
1.3.5. Гомеотические гены львиного зева и арабидопсиса, имеющие Вфункцию
1.3.6. Механизм, определяющий число и позицию примордий
1.3.7. Передача сигнаюв в меристеме из клетки в клетку и от клеток одною слоя к клеткам другого слоя
1 Раннее развитие цветка арабидопсиса
1.4. Трансформация растений
1.4.1. Трансформацня растительных клеток бактериями из рода АгоЬастсгшт.
1.4.2. Конструирование бинарных векторов i штеГааепв
1.4.3. Репоргерные гены, используемые в генетической инженерии растений
1.4.4. Наследование полученных признаков и экспрессия генов, перенесенных в трансгенные растения
1.4.5. Трансформация львиного зева с помощью агробактерии
2. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Почвенноклиматические условия проведения опытов
2.2. Растительный материал
2.3. Бактериальные штаммы и вектора
2.4. Химические реагенты, энзимы и радиоизотопы
2.5. Среды, буферы и растворы
2.6. Антибиотики
2.7. Выделение ДНК
2.8. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.9. Ревертазная ПЦР РТПЦР
2 Лигирование фрагментов ДНК в вектора для трансформации растений
2 Введение рекомбинантных плазмид в клетки .i и . i с помощью трансформации
2 Обработка ДНК ферментами рестрикции
2 Фракционирование ДНК методом электрофореза в агарозном геле
2 Перенос и гибридизация ДК по Саузерну
2 Секвеннрование ДНК
2 I vi трансформация растений и культура тканей львиного зева
2 I трансформация растений арабидопсиса
2 Электронное сканирование растительных образцов СЭмикроскоиня
2 Анализ эффективности трансформации растений при помоши конфокальной лазерной сканирующей микроскопии КЛСмикроскопнн
2 Анализ эффективности трансформации по окраске на
Зглюкуронидазу
2 I i гибридизация мРНК
2 Скрининг геномной библиотеки львиного зева и
клонирование промотора I
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЯ
3.1. Разработка протокола трансформации и регенерации львиного зева
3.1.1. Конструирование супервирулентных штаммов для трансформации
3.1.2. Подбор сред для регенерации львиного зева
3.1.3. Трансформация львиного зева i
3.1.4. Практическое значение разработанного протокола трансформации львиного зева
3.2. Изучение эпндермаспецифичной экспрессии двух растительных промоторов гомологичных генов и I
3.2.1. Конструирование векторов с промотором гена , экспрессирующих ген устойчивости к гигромицину в растениях
3.2.2. Активность промотора в трансгенных растениях львиного зева
3.2.3. Экспрессия мРНК гена I в тканях генеративной меристемы и цветка львиного зева
3.2.4. Клонирование промотора 1
3.2.5. Бинарные вектора с промотором I для трансформации арабидопсиса и львиного зева
3.2.6. Активность промотора I трансгенных растениях арабидопсиса
3.2.7. Активность промотора I трансгенных растениях львиного зева
3.2.8. Научное значение и практическое использование
специфичной экспрессии промотора I в эпидерме
3.3. Использование энилермаспеиифичной экспрессии для
изучения межклеточных взаимодействий в меристеме
3.3.1. Цели и задачи экспрессии кДНК генов II и под контролем Iпромотора в трансгенных растениях
3.3.2. Конструирование бинарных векторов, экспрессирующих кДНК генов под контролем Iпромотора
3.3.3. Получение трансгенных растений арабидопсиса, экспрессирующих и кДНК львиного
зева под контролем эпилермаспсцифичного промотора
3.3.4. Фенотип траисгенных растений I арабидопсиса
3.3.5. Генетическая комплементации гомеотичсскон мутации 3 арабидопсиса геном львиного зева при его экспрессии в эпидерме
3.3.6. Фенотип трансгенных растений I арабидопсиса
3.3.7. Фенотип двойных трансгенных растений IxI арабидопсиса
3.3.8. Экспрессия мРНК генов и в тканях генеративных меристем и цветков траисгенных растений IIxI арабидопсиса
3.3.9. Роль межклеточных взаимодействий и взаимодействий белков бокс генов класса В в установлении типа цветковых органов во втором и третьем концентрических кольцах цветка
3.3 Трансформация львиного зева бинарными векторами
с и под контролем промотора I и фенотип траисгенных растений
3.3 Перспективы анализа функций генов и в траисгенных растениях львиного зева
ВЫВОДЫ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


С помощью мРНК i i гибридизации па трансгенных растениях установлено отсутствие межклеточного переноса мРНК генов и из клеток слоя 1 в клетки внутрилежаших слоев 2 и 3 меристемы арабидопсиса. Впервые получены трансгенные растения львиного зева, экспрессирующие гомеот ические гены и . Установлено, что с помощью эпидермаспсцифичной экспрессии можно изменять морфолоппо цветсовых органов. Практическая значимость работы. Это свидетельствует о том, что она может успешно использоваться для повышения эффективности трансформации на других культурах. Разработанный протокол по регенерации и трансформации львиного зева успешно используется в лабораториях, изучающих развитие цветка львиного зева МаксПланк институте Кльн, Германия, в ДжонИннсс центре Норвич, Англия, в университет г. Лидса Лиле, Англия и в Королевском колледже Кембридж, Англия. Разработанный протокол имеет большое практическое значение в создании исходного материала для селекции с изменнной формой, размером и пигментацией цветков при помощи генетической трансформации. Энидсрмаспецнфичный промотор I успешно используется в программах лаборатории по трансформации. Получены трансгенные растения арабидопсиса и львиного зева, экспрессирующие в эпидерме ген класса С под контролем промотора I. Промотор 1 может использоваться всегда, когда необходимо изменить признаки эпидермы, такие как устойчивость к патогенам, окраску, продукцию эфирных масел, образование кутикулы, устьии и трихом. Он может использоваться и в том случае, когда экспрессии в эпидерме достаточно для изменения фенотипических признаков всего органа в растении. Практическим преимуществом гкансспецифичнон экспрессии является уменьшение накопления чужеродных белков по сравнению с конститутивной экспрессией в растении. Уже получены трансгенные растения львиного зева, экспрессирующие иол контролем промотора I в эпидерме один из иитохромов фиалки, кодирующий . Этот фермент играет роль в образовании пигмента дельфилина, определяющего голубую окраску в лепесках иветков растений 1, 2. У львиного зева, как и у многих других декоративных растений, этот пигмент отсутствует. Полученные растения могут иметь большое значение для выведения новых декоративных сортов львиного зева. Аналогичная стратегия может применяться и для создания плодов с определнной окраской кожуры 3. Создание и использование траисгеиных декоративных растений, и львиного зева в частности, имеет большие перспективы. Использование промотора I вместе с промотором для трансформации растений защищается Европейским патентом. Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 7м и 8м международных симпозиумах по львиному зеву Севилья, Испания, г. Кембридж, Англия, г. МаксПланк института селекции растений Кльн, Германия и на заседаниях кафедры селекции и семеноводства КГАУ Краснодар, Россия. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Льшшый зев ii та. Систематика, происхождение и биологические особенности львиного зева Львиный зев большой ii . Норичниковые одно из 7ми семейств порядка норичниковых i. Самые большие из них бигнонневые ii и подорожниковые i. Всего порядок насчитывает 0 ролов и 0 видов . Родиной львиного зева считается ЮгоЗападная Европа. Наибольшее видовое многообразие отмечается в Средиземноморье. Еще в Древнем Риме рол ii под именем ii широко использовался как декоративное растение. Первое ботаническое исследование рода было проведено и i в году. Название ii было дано в году Карлом Линнеем Львиный зев с начата века является одним из главных обткжтов классической генетики. Он был первым ботаническим объектом, на котором было подтверждено расщепление Менделя. Не зная результатов, полученных Менделем за три года до него на горохе, Дарвин в году скрестил львиный зев с зигоморфными и пелорическими цветками и получил расщепление потомства после самоопыления 9. Львиный зев травянистое растение с простыми, цельными, без прилистников, очередными, супротивными листьями. Соцветие цимоиднос, состоящее из множества больших, обоеполых, окрашенных зигоморфносимметричных цветков. Околоцветник двойной, гоггичленный. Чашечка правильная, состоит из 5ти свободных, коротких чашелистиков.